Perpustakaan Digital ITB

DNA polimerase digunakan dalam polymerase chain reaction (PCR) untuk membentuk untai DNA baru. DNA polimerase menggunakan cetakan DNA untuk mengarahkan sintesis DNA. Enzim reverse transkriptase (RTase) diperlukan sebagai enzim tambahan pada diagnosis berbasis RNA seperti deteksi patogen dan analisis ekspresi gen karena DNA polimerase tidak menerima cetakan RNA. Enzim RTase yang bersifat termolabil serta memiliki fidelitas yang rendah menyebabkan transkripsi balik kurang optimal. Tujuan penelitian ini adalah menghasilkan urutan DNA polimerase Thermus aquaticus mutan dengan peningkatan fidelitas dan aktivitas RTase. Urutan DNA polimerase famili A T. aquaticus mutan termostabil (Taq M2) dirancang dengan mensubtitusi 4 residu domain polimerase (L459M, S515R, I638F, M747K) dan penggantian domain 3’?5’ eksonuklease dengan domain koreksi fidelitas tinggi DNA polimerase famili B Pyrococcus furiosus. Urutan pembanding (Taq M1) dirancang tanpa penggantian domain koreksi untuk mengetahui pengaruh penggantian domain koreksi terhadap aktivitas RTase pada domain polimerase. Rancangan urutan DNA polimerase dianalisis dengan pendekatan struktur 3D. Pemodelan homology modelling dengan SWISSMODEL dilakukan menggunakan cetakan DNA polimerase T. aquaticus (PDB ID: 1TAQ). Struktur hasil pemodelan kemudian diperbaiki menggunakan Galaxy Refinement. Validasi struktur dengan MolProbity menunjukkan model struktur dapat diandalkan. Docking Taq M1 dan Taq M2 terhadap dupleks primer-RNA dengan HADDOCK menunjukkan kedua struktur dapat menerima cetakan RNA dengan posisi dan konformasi serupa. Hal ini menunjukkan bahwa penggantian domain 3’?5’eksonuklease tidak mempengaruhi aktivitas RTase pada domain polimerase. Hasil analisis interaksi dengan PyMOL menunjukkan 5 dari 6 residu asam amino yang sama pada Taq M1 dan Taq M2 berinteraksi dengan primer, serta 5 dari 8 residu asam amino yang sama berinteraksi dengan cetakan RNA. Hasil docking dan analisis interaksi menunjukkan urutan sekuens Taq M2 dengan peningkatan fidelitas dan aktivitas RTase. Hasil optimasi kodon urutan Taq M2 dengan inang Escherichia coli (BL21)DE3 dapat diterima dengan nilai CAI 0,745 dan persentase GC 52%.