Perpustakaan Digital ITB

Taq DNA polimerase merupakan jenis DNA polimerase komersial pertama dan paling banyak digunakan untuk aplikasi PCR. Taq DNA polimerase umumnya diproduksi menggunakan teknologi rekombinan dengan E. coli sebagai sel inang untuk produksi protein tersebut. Salah satu tantangan produksi Taq DNA polimerase rekombinan adalah tahapan pemurnian protein yang panjang, melibatkan purifikasi protein multitahap, dialysis, dan pemekatan. Penelitian ini bertujuan untuk menentukan proses dan pemurnian Taq DNA polimerase rekombinan yang diproduksi di E. coli BL21(DE3) agar lebih cepat, sederhana, dan tetap mempertahankan aktivitas enzim tersebut. Penelitian ini dimulai dengan membuat konstruk plasmid pET-16B-Taq dengan gen target Taq polimerase (Freegenes) pada plasmid pET-16B (Addgene) melalui metode Gibson Assembly. E. coli BL21(DE3) yang sudah ditransformasi dengan plasmid pET-16B-Taq ditumbuhkan pada media Luria Bertani (+ampisilin 100 ?g/mL) dengan variasi perlakuan suhu (30 ? dan 37 ?), induksi (0 ?M dan 250 ?M), dan waktu panen (8 jam dan 16 jam setelah induksi), dengan agitasi 150 rpm untuk mendapatkan jumlah protein target tertinggi. Proses ekstraksi protein meliputi pemecahan sel dengan sonikasi dan pemisahan bagian sel lain melalui sentrifugasi. Crude protein selanjutnya dilakukan denaturasi panas untuk memisahkan Taq DNA polimerase dengan protein yang tidak tahan panas. Visualisasi pada SDS PAGE menunjukkan bahwa produksi protein Taq DNA polimerase tertinggi diperoleh dari kultur produksi yang diinkubasi pada 37°C tanpa penambahan IPTG, dan ditumbuhkan selama 10 jam. Proses pemekatan dan pemurnian Taq DNA polimerase dilakukan melalui 4 cara yaitu ultrafiltrasi, kromatografi afinitas disertai dialisis, presipitasi amonium sulfat disertai dialisis, dan presipitasi pelarut organik. Analisis SDS PAGE menunjukkan bahwa titer Taq DNA polimerase tertinggi diperoleh melalui presipitasi pelarut organik B dan D yaitu sebesar 0.75 mg/ml atau setara 2.99 mg/ L kultur. Metode lain berturut-turut dari tertinggi adalah sebagai berikut: : presipitasi pelarut organik A (0.67 mg/ml atau setara 2.69 ml/L kultur), kromatografi afinitas disertai dialisis (0.53 mg/ml atau setara 2.64 mg/L kultur), ultrafiltrasi (0.62 mg/ml atau setara 2.47 mg/L kultur), presipitasi pelarut organik C (0.61 mg/ml atau setara 2.69 mg/L kultur), presipitasi ammonium sulfat disertai dialisis (0.43 mg/ml atau setara 2.14 mg/L kultur), dan presipitasi pelarut organik E (0.46 mg/ml atau setara 1.85 mg/L kultur). Aktivitas enzim Taq DNA polimerase yang diujikan dalam reaksi PCR dengan gen target Pfu (Addgene) sebesar 2528 bp menunjukkan adanya aktivitas enzim polimerase pada seluruh sampel pemurnian dengan batas penggunaan hingga 0.05 mg dalam 20 ?L reaksi dibandingkan dengan 0.5 Unit kontrol enzim Taq DNA polimerase rekombinan komersial (Thermo Fisher). Proses pemekatan D yang memiliki intensitas pita DNA terbaik dibandingkan dengan komersial pada konsentrasi penggunaan 0.05 mg. Penelitian ini telah berhasil memproduksi Taq DNA polimerase yang fungsional, dengan presipitasi pelarut organik D menunjukkan waktu proses pemurnian yang lebih singkat dan efektif jika dibandingkan dengan proses pemurnian lainnya yang diujikan di penelitian ini.