Perpustakaan Digital ITB

Diabetik nefropati (DN) merupakan salah satu penyakit mikrovaskular yang dipicu dari kondisi hiperglikemik dapat menyebabkan penyakit ginjal stadium akhir. Adapun kendala pada pengobatan konvensional DN yaitu efektivitas obat yang rendah. Hal ini dikarenakan tujuan terapi yang ada saat ini lebih diarahkan pada terapi simptomatik tanpa memperbaiki asal mula penyakit itu berasal. Transforming growth factor-beta 1 (TGF-?1) merupakan faktor utama dalam DN. Pada penelitian ini digunakan terapi berbasis asam nukleat CRISPR-Cas9 dengan menggunakan sistem penghantaran Lipid Nanoparticles (LNP) yang ditargetkan untuk menurunkan ekspresi dari TGF-?1. Penelitian ini menggunakan plasmid Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP) untuk mengkonfirmasi kemampuan LNP dalam menghantarkan gen pEGFP-C1 masuk ke dalam nukleus. Konfirmasi keberhasilan penghantaran EGFP diamati dengan confocal microscopy. Gen pEGFP-C1 digunakan sebagai model asam nukleat dalam optimasi formula LNP yang digunakan dalam penghantaran CRISPR-Cas9. Untuk meningkatkan akumulasi LNP pada area target, modifikasi permukaan LNP dilakukan dengan menggunakan polietilen glikol (PEG). Penambahan PEG pada formulasi diharapkan dapat memberikan peningkatan waktu sirkulasi in vivo sehingga terjadi peningkatan akumulasi LNP pada area target. Pada penelitian ini, sel Human Embryonic Kidney (HEK) 293T digunakan sebagai model sel yang mampu mengekspresikan TGF-?1. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengkaji sistem penghantaran CRISPR- Cas9 dengan sistem LNP baik dari segi formulasi dan uji aktivitas in vitro dengan target gen TGF-?1 pada ginjal DN. Tahap pertama yaitu formulasi LNP terdiri dari optimasi formula, karakterisasi LNP, uji viabilitas sel terhadap LNP dengan CCK-8, studi cellular uptake, analisis ekspresi EGFP, serta evaluasi sirkulasi LNP-PEG2000-DSPE dalam darah. Tahap kedua yaitu uji in vitro menggunakan HEK 293T sel dengan analisis yang dilakukan yaitu pengukuran ekspresi gen target dengan menggunakan qRT-PCR dan ELISA. Hasil optimasi dan karakterisasi LNP baik blanko, LNP penambahan PEG2000- DSPE, maupun pada penambahan pEGFP-C1 memiliki karakteristik ukuran partikel berkisar 50-100 nm dengan muatan partikel -10 hingga +10 mV. Indeks polidispersitas pada tiap formula menunjukkan keseragaman ukuran yang baik ditunjukkan nilai <0,5. Efisiensi penjerapan dari LNP-pEGFP-C1 juga menunjukkan penjerapan yang baik yaitu 91,62±3,895%. Uji viabilitas sel terhadap LNP diperoleh nilai total lipid pada kisaran 2,51-10,04 mM dengan viabilitas sel >70%, yang menunjukkan konsentrasi yang bisa digunakan dalam pengujian in vitro berikutnya. Selain itu, pengujian cellular uptake LNP-DiD diperoleh hasil endositosis LNP melalui caveolae dengan penghambatan sebesar 71,1% dibandingkan dengan kontrol. Pengujian selanjutnya, LNP ini mampu masuk ke dalam nukleus ditandai dengan adanya ekspresi EGFP sebagai hasil dari penghantaran pEGFP-C1 oleh LNP ke dalam sel. Hasil ini menunjukkan kemampuan LNP menghantarkan asam nukleat, yang kemudian diterapkan untuk sistem CRISPR-Cas9. Selanjutnya, sgRNA dirancang dengan penargetan pada Ekson 3 TGF-?1. Sekuens sghTGFb1 disisipkan pada plasmid pUC57 dan diperbanyak di Escherichia coli Top 10. Kemudian, plasmid dikarakterisasi ukuran dan urutannya. Plasmid yang telah dikonfirmasi, direstriksi dengan enzim XbaI, dimurnikan, dan digunakan sebagai cetakan untuk transkripsi in vitro. sgRNA yang dihasilkan, dikompleksasi bersama protein Cas9. Hasil optimasi dan karakterisasi LNP-CRISPR-Cas9 diperoleh karakteristik ukuran partikel berkisar 65,30-105,40 nm dengan muatan partikel -1,97 hingga -2,51 mV. Indeks polidispersitas LNP-CRISPR-Cas9 menunjukkan keseragaman ukuran yang baik dengan nilai <0,5. Evaluasi sirkulasi LNP-PEG2000-DSPE menunjukkan peningkatan %ID/mL darah seiring dengan peningkatan konsentrasi PEG2000- DSPE yang ditambahkan pada LNP. Uji in vitro analisis ekspresi gen digunakan LNP-CRISPR-Cas9 pada qRT-PCR dan ELISA dengan variasi formula F1, F2, F3, dan F4 dengan masing-masing perbandingan Cas9:sgRNA 1:1, 1:2, 2:2, dan 2:4. Hasil analisis qRT-PCR ekspresi gen TGF-?1 menggunakan perhitungan relative gene expression dengan persamaan pfaffl method. Setelah transfeksi LNP-CRISPR-Cas9, hasil analisis diperoleh penurunan ekspresi gen pada TGF-?1 masing-masing 39%, 67%, 75%, and 78% dibandingkan dengan LNP-blanko. Hasil analisis ekspresi protein TGF ?1 pada ELISA menunjukkan penurunan %TGF-?1 masing-masing 0%, 16%, 7%, dan 22%. Hasil analisis ekspresi gen ini menunjukkan bahwa F4 memberikan efikasi yang lebih baik diikuti F2 dibandingkan kelompok yang lain. Hasil ini juga menunjukkan Cas9:sgRNA dengan perbandingan 2:4 dan 1:2 memberikan efikasi yang lebih baik dibandingkan 2:2 dan 1:1. Hasil penelitian ini berupa sistem penghantaran berbasis lipid nanoparticles yang dikembangkan didesain untuk mampu menghantarkan beberapa tipe asam nukleat seperti pDNA dan sistem CRISPR-Cas9, dengan efektivitas penghantaran ke nukleus yang sebanding pada beberapa tipe lini sel belum pernah diteliti sebelumnya.