Perpustakaan Digital ITB

Hepatitis B merupakan masalah kesehatan serius di Indonesia, dengan sekitar 17.5 juta penderita dan tingkat diagnosis hanya 2.8% di Asia Tenggara. Keberadaan 10 genotipe dan 9 sub-genotipe virus Hepatitis B (HBV) yang tersebar secara geografis menunjukkan pentingnya pengembangan metode diagnosis Point-of-Care (PoC) yang sesuai dengan kebutuhan di Indonesia. Dalam beberapa tahun terakhir, sistem Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats-Cas9 (CRISPR-Cas9) telah berkembang pesat dan banyak diaplikasikan untuk diagnostik karena keunggulannya dalam hal sensitivitas, spesifisitas, efisiensi, dan kemudahan penggunaan. Dikembangkan oleh Wang et al. pada tahun 2020, sistem CASLFA (CRISPR-Cas9-mediated Lateral Flow Nucleic Acid Assay) merupakan perangkat diagnostik yang menggabungkan Lateral Flow Assay (LFA) dengan CRISPR-Cas9. Integrasi ini memungkinkan deteksi dalam kurun waktu 40 menit dengan akurasi yang setara dengan standar emas diagnostik. Selain itu, CASLFA dirancang ringkas, fleksibel, dan mudah dioperasikan, sehingga cocok untuk digunakan di daerah dengan sumber daya terbatas. Skripsi ini menyajikan hasil studi in silico dan in vitro dari sistem CRISPR-Cas9 sebagai pengembangan awal kit diagnostik. Studi dimulai dengan analisis 33.533 sekuens gen S yang mewakili seluruh 10 genotipe HBV, diunduh dalam bentuk dataset dari HBVdb. Hasil penjajaran kemudian digunakan untuk merancang sgRNAneg25 yang menargetkan nukleotida ke-25 hingga ke-46 pada untai negatif. Pohon filogenetik berbasis metode maximum likelihood (ML) menunjukkan bahwa sekuens konsensus tersebut cukup representatif terhadap variasi regional HBV yang unik di Indonesia. Analisis struktur sekunder dengan RNAfold menunjukkan bahwa sgRNAneg25 memiliki motif struktural penting seperti repeat and anti-repeat region (RAR), stem-loop kedua, dan stem-loop ketiga. Selain itu, nilai minimum free energy (MFE) sebesar -35.19 kcal/mol menunjukkan bahwa struktur RNA terbentuk dengan stabil.sgRNA25 disintesis melalui in vitro transcription (IVT) dan menunjukkan dua pitaberbeda pada hasil elektroforesis gel. Pita yang bermigrasi lebih lambat tetapmuncul meskipun sudah diberi perlakuan DNase serta penggunaan template daridouble-stranded DNA (dsDNA) sintetik, sehingga diduga merupakan variasistruktur dari sgRNA25. Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) menunjukkanbahwa Cas9 mampu mengenali sgRNA25 dan membentuk kompleksribonukleoprotein (RNP), yang ditandai dengan pergeseran migrasi dan perubahanintensitas pita. Hasil EMSA juga mengindikasikan preferensi pengenalan Cas9untuk struktur sekunder tertentu dari sgRNA25. Uji aktivitas endonuklease secara invitro menunjukkan kemampuan kompleks RNP dalam mengenali target melaluimigrasi kompleks RNP-DNA yang konsisten lebih lambat di gel. Uji yang samatidak menunjukkan hadirnya aktivitas pemotongan, bahkan pada sgRNA kontrolpositif dengan Cas9 hasil produksi maupun komersial. Dengan demikian, hasil inimenggarisbawahi kemampuan RNP sgRNA25-Cas9 dalam mengenali target tanpamenunjukkan aktivitas pemotongan.