Perpustakaan Digital ITB

Cabai (Capsicum annuum) merupakan salah satu komoditas penting yang banyak dikonsumsi di Indonesia. Varietas cabai Lembang-1 merupakan varietas cabai yang banyak ditanam karena menghasilkan buah dan benih yang tinggi. Meskipun begitu, varietas ini diketahui rentan terhadap patogen. miR2059 merupakan salah satu miRNA yang meregulasi kemampuan pertahanan tanaman secara negatif dengan membungkam ekspresi gen putative disease resistance protein (PDRP) RGA1 yang meregulasi respon stress biotik pada tanaman. Delesi gen miR2059 diduga akan meningkatkan pertahanan tanaman dengan meningkatkan ekspresi PDRP RGA1. Salah satu metode edit genom yang telah banyak dilakukan untuk delesi adalah CRISPR/Cas9. CRISPR/Cas9 pada tanaman dapat diaplikasikan dengan metode agroinfiltrasi yang menginsersikan konstruk CRISPR/Cas9 ke genom tanaman secara transien dengan murah dan cepat. Penelitian ini bertujuan untuk melakukan insersi konstruk CRISPR/Cas9 ke dalam genom tanaman serta menentukan keberhasilkan delesi gen miR2059 oleh CRISPR/Cas9. Plasmid 1432 yang membawa konstruk CRISPR/Cas9 dan guideRNA (gRNA) tandem ditransformasi ke dalam A. tumefaciens EHA105 dan GV3103 untuk diinsersikan dengan metode agroinfiltrasi ke daun cabai. Agroinfiltrasi daun cabai menggunakan plasmid pCambia1304 yang memiliki reporter GUS juga dilakukan sebagai pembanding. DNA dari daun yang telah ditransformasi dengan plasmid 1432-gRNA2059 kemudian diisolasi. Selanjutnya, dilakukan PCR untuk mengetahui keberhasilan integrasi area CRISPR/Cas9 konstruk ke genom cabai dan delesi gen. Primer untuk PCR deteksi delesi gen miR2059 didesain untuk mengamplifikasi area sebelum hulu hingga setelah hilir tandem gRNA sepanjang 715 pb. Delesi gen yang terjadi akan menghasilkan amplicon sepanjang ±600 pb karena daerah target tandem gRNA sepanjang 109 pb terdelesi dan perbaikan terjadi melalui mekanisme non-homologous end joining (NHEJ). Hasil transfeksi dengan pCambia1304 menunjukkan daun cabai Lembang-1 dapat ditransformasi menggunakan A. tumefaciens galur EHA105 dan GV3103 dengan GV3103 signifikan lebih efisien. Integrasi konstruk CRISPR/Cas9 ke genom tanaman berhasil ditunjukkan dengan adanya pita berukuran ±650 pb pada hasil PCR dengan pasangan gRNA sebagai primer. Sedangkan, tidak ditemukannya pita berukuran ±600 pb dengan menggunakan primer spesifik gen mengindikasikan bahwa delesi gen miR2059 belum terjadi. Hal ini dapat disebabkan karena kurang efektifnya sgRNA dan efisiensi transformasi, yang juga didiskusikan pada skripsi ini.