Perpustakaan Digital ITB

Hiperkolesterolemia Familial (HF) merupakan penyakit genetik autosomal dominan yang disebabkan oleh mutasi salah satunya pada gen Low-Density Lipoprotein Receptor (LDLR). Hal ini mengakibatkan gangguan metabolisme kolesterol yang disebabkan oleh terjadinya penurunan kadar protein LDLR sehingga menimbulkan peningkatan risiko penyakit kardiovaskular. Prevalensi HF di Indonesia mencapai 1:500 dengan risiko memperparah kondisi penyakit jantung koroner 3,5-16 kali lebih tinggi dibandingkan populasi normal. Terapi konvensional dengan obat golongan statin dinilai kurang optimal karena hanya mengelola efek tanpa memperbaiki kerusakan genetik. Oleh karena itu, penelitian ini bertujuan mengembangkan sistem penghantaran materi genetik untuk terapi pengeditan gen menggunakan CRISPR/Cas9 guna memperbaiki mutasi spesifik pada gen LDLR ekson 4 yang mengakibatkan terjadinya disfungsi serta penurunan kadar protein LDLR. Penghantaran yang dikembangkan adalah vektor non virus berbasis lipid yaitu Lipid Nanoparticle (LNP). Tahapan penelitian diawali dengan optimasi formulasi LNP yang meliputi optimasi rasio surfactant: oil (S:O), optimasi kecepatan dan durasi pencampuran pada penggunaan alat Homogenizer Ultra-turrax dan Probe Sonicator. LNP kemudian dievaluasi untuk mengetahui karakteristiknya meliputi uji ukuran dan distribusi ukuran partikel, zeta potensial, morfologi secara optik menggunakan TEM, serta karakterisasi gugus fungsi dengan FTIR. Selain pengamatan secara fisikokimia, LNP yang diproduksi juga dilakukan pengujian efisiensi penjerapan (%EE), uji viabilitas sel serta cellular uptake. Proses ini penting untuk memastikan bahwa LNP memiliki karakteristik yang sesuai dengan target kerja yaitu sel hepatosit tikus (sel Hepa1-6 wt). Selanjutnya, dilakukan perancangan sgRNA dan Donor DNA sebagai bagian dari sistem CRISPR/Cas9 yang berperan dalam proses pengeditan gen. Kompleks LNP dengan materi genetik ini selanjutnya ditransfeksikan ke sel Hepa1-6 LDLR mt dimana sel ini merupakan sel normal dengan mutasi pada gen LDLR ekson 4. Sel ini adalah representasi dari sel yang mengalami HF. Efektivitas dari LNP kompleks terhadap sel mutan diukur dari kadar protein LDLR dengan ELISA. Berdasarkan hasil optimasi, LNP diformulasikan dengan komponen lipid kationik (DOTAP), Squalene, Glyceryl Trimyristate, Span 60, dan Tween 80 dengan rasio surfactant: oil (S:O) 7:5. Untuk meningkatkan stabilitas dan efisiensi penghantaran, digunakan polimer Fosfolipid terPEGilasi yaitu DSPE-PEG2000-NH2 sebesar 0,3% w/v dan Polyethylenimine 0,08% w/v. LNP diformulasikan menggunakan teknik ultrasonic solvent emulsification dengan Homogenizer Ultra-turrax (7200 rpm, 5 menit) dan Probe Sonicator (20 menit). Hasil karakteristik LNP meliputi ukuran partikel sebesar 118,6±0,8 nm dengan nilai distribusi ukuran partikel 0,347±0,030; zeta potensial sebesar 7,5 mV; serta hasil uji TEM menunjukkan morfologi LNP berbentuk sferis dengan efisiensi penjerapan 88,01±0,86%. Berdasarkan uji viabilitas diperoleh nilai IC50 yaitu 27,7 mM. Cellular uptake LNP terjadi melalui mekanisme endositosis dengan jalur dominan yaitu Clathrin-Mediated Endocytosis (CME). Sel mutan diproduksi sebagai sel model untuk uji in vitro pada HF. Sel ini diperoleh melalui transfeksi Lipofectamine 3000 dengan rasio sgRNA: Cas9: Donor DNA mt yaitu 2: 1: 0,04. Sel mutan menunjukkan penurunan kadar protein LDLR (8,94±0,75 ng/mL) secara signifikan dibandingkan sel normal (13,85±0,63 ng/mL). Pada uji efektivitas, LNP dikompleksasi dengan sgRNA, Cas9, dan Donor DNA wt dengan rasio 1: 1: 0,04. Selanjutnya LNP kompleks ditransfeksikan ke sel mutan. Hasil menunjukkan peningkatan signifikan pada hari ke-4 pasca-transfeksi (12,95±0,62 ng/mL) terhadap kadar protein LDLR sel mutan (9,88±0,89 ng/mL). Hal ini mengindikasikan terjadinya keberhasilan pengeditan gen dengan adanya peningkatan produksi protein LDLR. Penelitian ini membuktikan bahwa formula LNP yang dikembangkan telah efektif sebagai sistem penghantaran materi genetik untuk terapi HF secara in vitro. Namun, penelitian lebih lanjut diperlukan, seperti pengujian in vivo untuk evaluasi biodistribusi, toksisitas jangka panjang, dan efikasi terapi pada hewan coba. Selain itu, perancangan sgRNA alternatif dapat dioptimasi untuk meningkatkan spesifisitas pengeditan gen untuk jenis mutasi lainnya pada HF.