Perpustakaan Digital ITB

Sistem CRISPR/Cas9 adalah teknik biologi molekuler yang merevolusi penelitian genetika dan biologi moluker. Agar dapat bekerja, CRISPR/Cas9 harus bisa masuk ke dalam inti sel target. Metode transfeksi kompleks ribonukleoprotein fungsional ke dalam sel target lebih diminati dalam beberapa bidang karena cepat, akurat, dan bebas transgen. Walaupun begitu, produksi protein rekombinan Cas9 masih menjadi tantangan karena protein Cas9 cenderung membentuk badan inklusi yang tidak aktif. Sistem rekayasa chaperone molekuler telah digunakan untuk meningkatkan produksi protein rekombinan dalam wujud terlarut. Pada studi ini dilakukan implementasi strategi berbasis ko-translasi chaperone, chaperonesubstrate co-localized expression (CLEX), untuk meningkatkan kelarutan protein Cas9 yang diekspresikan pada Escherichia coli. Sistem ini mengkombinasikan ekspresi chaperone DnaJ dan protein Cas9 menggunakan kodon start-stop tumpang tindih 5?-TAATG-3? dalam suatu sistem bisistronik sedemikian rupa sehigga chaperone molekuler bakteri dibatasi secara spasial ke lokasi translasi Cas9. Penelitian ini terdiri dari beberapa tahap yakni desain dan konstruksi plasmid ekspresi Cas9 CLEX, uji solubilitas Cas9, dan uji aktivitas Cas9. Konstruk genetik sistem eskpresi ini dirakit dengan metode overlap-extension PCR dan diintegrasi ke dalam vektor ekspresi pRSFDuet-1 dengan kloning restriksi. Pada studi ini, konstruk gen DnaJ yang berada di posisi upstream dari Cas9 berhasil dibuat. Ekspresi Cas9 dilakukan menggunakan inang Escherichia coli BL21(DE3) dan efek pelarutan protein dievaluasi dengan melakukan SDS-PAGE terhadap sampel protein fraksi terlarut dan tak-terlarut. Kondisi ekspresi yang diuji berupa variasi suhu dan durasi ekspresi. Hasil penelitian menunjukkan bahwa sistem CLEX Cas9 diduga memberikan beban metabolik yang berlebih terhadap sel inang sehingga perolehan Cas9 yang dihasilkan lebih rendah dan tingkat kelarutan yang lebih rendah. Di sisi lain, ekspresi di suhu yang rendah (18°C) memberikan pengaruh positif terhadap perolehan dan pelarutan Cas9 dengan sistem CLEX maupun tidak. Cas9 yang dihasilkan menggunakan sistem CLEX dipurifikasi dengan kromatografi kolom afinitas Ni-NTA dan ultrafiltrasi. Aktivitas endonuklease Cas9 diuji menggunakan sgRNA yang menarget substrat dsDNA gen eIF4E1 dan dianalisis dengan elektroforesis gel agarosa. Perolehan Cas9 murni dengan sistem CLEX adalah 0.463 mg per 100 mL kultur yakni 2.3 kali lipat lebih rendah dibanding kontrol. Walaupun begitu, Cas9 yang dihasilkan dengan CLEX menunjukkan aktivitas endonuklease yang normal. Secara umum, berdasarkan studi ini, sistem CLEX dengan DnaJ di bagian hulu bekerja lebih baik pada suhu 18°C untuk produksi protein berukuran besar.