Perpustakaan Digital ITB

Kultivar cabai besar (Capsicum annuum L.) Inata Agrihorti adalah cabai hibrida dengan keunggulan berumur genjah dan memiliki daya produksi yang tinggi. Meskipun memiliki banyak kelebihan, kultivar-kultivar cabai di Indonesia termasuk Inata Agrihorti masih rentan terhadap serangan berbagai patogen, termasuk di antaranya infeksi oleh Potyvirus. Aplikasi teknologi edit genom CRISPR/Cas9 dinilai dapat berkontribusi untuk menyelesaikan masalah ini dengan cara membungkam gen kerentanan. Metode CRISPR/Cas9 dapat dilakukan secara transgenik maupun non-transgenik dengan resiko lebih rendah dari sisi lingkungan. Maka dari itu, penelitian ini ditujukan untuk memperoleh metode transfeksi yang optimal untuk plasmid dan protein Cas9 secara transien ke dalam protoplas cabai Inata Agrihorti sebagai langkah penting dalam aplikasi edit genom non-transgenik. Penelitian ini terdiri atas tiga tahapan optimasi metode yang meliputi optimasi isolasi protoplas mesofil cabai serta optimasi transfeksi plasmid GFP:NLS (pK7WGF2) dan juga protein Cas9:NLS:GFP ke dalam protoplas yang dimediasi oleh polietilen glikol (PEG). Optimasi isolasi protoplas mesofil cabai dilakukan dengan menggunakan metode Tape Sandwich dikombinasikan dengan enzim selulase (1% - 2%) dan maserozim (0,2% - 0,4%) dalam tiga durasi waktu inkubasi (1 jam, 2 jam, dan 3 jam). Berdasarkan hasil optimasi tersebut, diperoleh rata-rata jumlah protoplas tertinggi sebanyak 133,25 x 104 sel/mL per 0,1 g daun cabai dengan kombinasi 2% selulase dan 0,4% maserozim dalam waktu 3 jam inkubasi. Optimasi transfeksi plasmid bertujuan untuk menguji pengaruh konsentrasi plasmid (2.5 dan 5 ?g/50?L) dalam 40% PEG 4000 dan PEG 6000 terhadap efisiensi transfeksi protoplas. Efisiensi transfeksi plasmid tertinggi sebesar 48,71% diperoleh dari pemberian perlakuan konsentrasi 5 ?g/50?L plasmid dan 40% PEG 4000. Optimasi transfeksi protein Cas9 dilakukan untuk menguji pengaruh tiga perlakuan konsentrasi protein (50, 100, dan 1000 ?g/100?L) terhadap efisiensi transfeksinya ke dalam protoplas menggunakan 40% PEG 4000. Rata-rata efisiensi transfeksi protein Cas9 terbaik sebesar 2,9% diperoleh dari pemberian 1000 ?g protein. Hasil-hasil tersebut menunjukkan bahwa metode yang telah dioptimasi dapat digunakan dalam usaha pemuliaan tanaman cabai dengan menggunakan sistem CRISPR/Cas9 secara non-transgenik.