Perpustakaan Digital ITB

Abstrak dapat dibaca pada file yang sudah tersedia Sistem CRISPR/Cas9 dapat digunakan untuk melakukan pengeditan genom spesifik bebas transgen pada berbagai organisme. Sistem ini menginduksi doublestrand break pada situs spesifik DNA genom yang berujung pada terjadinya mutasi insersi-delesi sehingga dapat digunakan untuk gene knockout. Agar dapat berfungsi, sistem ini membutuhkan protein Cas9 dan single-guide RNA (sgRNA) yang perlu digabungkan menjadi kompleks ribonukleoprotein (RNP). Saat ini, sistem CRISPR/Cas9 yang memanfaatkan transformasi RNP Cas9-sgRNA dinilai lebih baik karena menghasilkan dampak yang lebih cepat dan terkontrol dibandingkan transformasi plasmid maupun mRNA. Dalam pengembangannya, sistem ini masih memerlukan desain sgRNA yang spesifik dan optimasi produksi protein Cas9 agar dapat menghasilkan RNP Cas9-sgRNA yang fungsional. Oleh karena itu, penelitian ini dilakukan dengan tujuan untuk mendesain sgRNA yang spesifik, menentukan konsentrasi IPTG optimum untuk ekspresi Cas9, memproduksi dan menguji aktivitas RNP Cas9-sgRNA. Penelitian ini terdiri dari beberapa tahap yakni desain dan produksi sgRNA, optimasi ekspresi Cas9, produksi dan purifikasi protein Cas9, serta pembentukan dan pengujian aktivitas endonuklease dari RNP Cas9-sgRNA secara in vitro. sgRNA didesain secara in silico menggunakan Cas-Designer dan diproduksi menggunakan in vitro transcription. Sebagai model, gen eIF4E1 dari Capsicuum anuum L. (AF521965.1) digunakan sebagai target CRISPR/Cas9. Produksi Cas9 dilakukan menggunakan Escherichia coli BL21(DE3) yang mengandung plasmid 4xNLS-pMJ915v2-sfGFP yang mengkodekan fusi NLSCas9- sfGFP dengan tag purifikasi histidine serta situs pemotongan TEV protease. Pada penelitian ini, sgRNA dengan target basa ke-300 eIF4E Capsicum annuum L. berhasil didesain. Hasil SDS-???????????????????? ???????????????????????????????????????????????? ???????????????????????????????? ???????????????? ???????????? ???????????????????? menghasilkan ekspresi Cas9 yang optimum pada pengujian dengan variasi konsentrasi 0-????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????Cas9 dengan kromatografi Ni-NTA dan pemotongan tag berhasil dilakukan. Namun, protein latar E. coli BL21(DE3) masih teramati walaupun sudah melewati proses dialisis dan ultrafiltrasi. Hasil rapid agarose electromobility shift assay (EMSA) menunjukkan kompleks RNP Cas9- sgRNA berhasil terbentuk. Kompleks yang terbentuk terbukti memiliki aktivitas endonuklease dengan teramatinya pemotongan DNA eIF4E1 menjadi dua fragmen berukuran sesuai dengan prediksi in silico berdasarkan visualisasi dengan elektroforesis gel agarosa. Diharapkan RNP yang diperoleh dapat mengedit genom dengan spesifik dan terkontrol di dalam sel target.