Perpustakaan Digital ITB

Ektoin merupakan asam amino siklik yang diproduksi secara intraseluler oleh bakteri sebagai respon untuk dapat tumbuh pada kondisi lingkungan dengan kadar garam tinggi. Penelitian ini bertujuan untuk melakukan konstruksi operon gen ektoin asal Virgibacillus salarius dengan berbagai desain konstruksi yang berbeda menggunakan BASIC assembly dilanjutkan dengan produksi ektoin pada Escherichia coli BL21(DE3). Konstruksi klaster gen ektoin diawali dengan melakukan isolasi klaster gen ektoin menggunakan set primer ectA forward dan ectC reverse. Klaster gen ektoin berhasil diisolasi dengan panjang ±2200 bp untuk selanjutnya dimasukkan ke dalam plasmid yang dirancang dengan metode BASIC assembly, menggunakan urutan Ribosome Binding Site (RBS) yang berbeda yaitu variasi T1 (RBS1-EctABC), T2 (RBS2-EctABC), dan T3 (RBS3-EctABC). Setelah seluruh plasmid selesai dirakit, plasmid ditransformasikan ke dalam bakteri E. coli DH5? untuk dilakukan konfirmasi dan selanjutnya ditransformasikan ke E. coli BL21(DE3) untuk proses produksi ektoin menggunakan senyawa induksi berupa IPTG dengan konsentrasi 0,1 mM. Produksi ektoin pertama dilakukan untuk melihat pengaruh induksi IPTG dan lokasi tempat akumulasi ektoin dihasilkan selama proses fermentasi. Variasi T3 yang memiliki RBS terkuat dipilih sebagai sampel awal dalam produksi ektoin dimana hasil menunjukkan terdapat ektoin sebesar 0,313 ± 0,021 gr/L pada medium fermentasi dan akumulasi ektoin yang lebih dominan berada pada ekstraseluler. Produksi selanjutnya difokuskan untuk melakukan analisis ekstraseluler ektoin pada variasi T1, T2, dan T3 dalam melihat pengaruh kekuatan RBS yang berbeda pada setiap koloni transforman. Hasil menunjukkan bahwa sampel T3 yang di induksi dengan IPTG 0,1 mM memiliki konsentrasi tertinggi jika dibandingkan dengan koloni T1 dan T2 dengan konsentrasi sebesar 0,36 ± 0,03 gr/L. Selanjutnya dilakukan konstruksi pada operon gen ektoin menggunakan RBS berbeda untuk setiap gen ektoin di dalam satu jalur biosintesis ektoin yaitu variasi B1 (RBS1-EctA-RBS2- EctB-RBS3-EctC) dan B4 (RBS1-EctA-RBS3-EctB-RBS3-EctC). Analisis konsentrasi ektoin juga dilakukan pada variasi B1 dan B4 untuk melihat pengaruh RBS berbeda pada setiap gen ektoin dalam satu jalur biosintesis ektoin, dimana hasil tertinggi dihasilkan pada variasi B4 dengan konsentrasi ektoin sebesar 0,30 ± 0,06 gr/L. Namun produksi ektoin pada variasi B4 lebih rendah jika dibandingkan dengan variasi T3. Selanjutnya, optimasi konsentrasi IPTG dari 0 mM, 0,1 mM, 0,5 mM, dan 1mM dilakukan pada sampel T3 sebagai sampel dengan produksi ektoin tertinggi pada percobaan sebelumnya. Berdasarkan hasil optimasi produksi ektoin diperoleh hasil bahwa sampel T3 dengan induksi IPTG 0,1 mM memiliki produksi ektoin yang berbeda nyata dengan konsentrasi ektoin sebesar 0,37 ± 0,018 gr/L (p < 0,05). Hasil dari penelitian ini menunjukkan bahwa sampel T3 memiliki potensi untuk dapat dilakukan produksi dengan skala besar, namun masih memerlukan berbagai optimasi lanjutan seperti optimasi senyawa induksi, kandungan glukosa, ataupun dengan penambahan exogenous enzim untuk mencegah adanya feed-back inhibition dari prekursor ektoin.