Enzim siklodekstrin glikosiltransferase (CGTase) dapat mengkatalisis pembentukan siklodekstrin (CD) dengan substrat polisakarida. Produksi CD seringkali difokuskan kepada bentuk ? (CD-?). Salah satu usaha untuk mengembangkan sistem produksi CD-? adalah optimasi jenis substrat. Pada penelitian sebelumnya telah digunakan CGTase rekombinan (rCGTase) dari Bacillus sp. A2-5a yang sudah dikarakterisasi kinerjanya menggunakan pati sagu (Metroxylon sagu). Penelitian kali ini bertujuan untuk mempelajari aktivitas rCGTase terhadap kandidat substrat baru untuk menghasilkan CD-? yaitu pati dan maltodekstrin dari batang nanas (Ananas comosus). Pengujian awal terhadap kedua substrat menggunakan media agar fenoftalin termodifikasi menunjukkan potensi terbentuknya CD-?. Pengujian kuantitatif selanjutnya dilakukan terhadap kedua substrat pada konsentrasi 0,5% dengan rCGTase murni 0,02 UA; suhu 55°C; pH 6; durasi 30 menit. Kuantifikasi berdasarkan metode kolorimetri menunjukkan bahwa produksi CD-? oleh pati batang nanas adalah sebesar 52,706 µg/mL sementara pada penggunaan substrat maltodekstrin dari batang nanas membutuhkan pengukuran lebih lanjut menggunakan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT).