Perpustakaan Digital ITB

Pati merupakan biopolimer alami yang berperan penting sebagai cadangan energi pada tanaman dan tersimpan dalam bentuk granula di biji, akar, serta umbi. Pati tersusun atas dua komponen utama, yaitu amilosa dan amilopektin. Pati memiliki nilai ekonomi tinggi karena dapat dihidrolisis secara enzimatis menjadi gula sederhana yang berfungsi sebagai bahan baku pada produk pangan, farmasi, tekstil, maupun bioetanol. ?-Amilase (1,4-?-D-glukan-glukanohidrolase, EC 3.2.1.1) adalah salah satu enzim penghidrolisis pati yang paling banyak digunakan. Enzim ini memutus ikatan ?-1,4-glikosidik pada rantai polisakarida sehingga menghasilkan oligosakarida linear maupun bercabang. Menurut basis data CAZy (Carbohydrate-Active enZyme), sebagian besar ?-amilase dikelompokkan dalam keluarga glikosida hidrolase GH 13. Keluarga GH13 dicirikan oleh keberadaan triad katalitik lestari, yaitu aspartat sebagai nukleofil, glutamat sebagai donor proton, dan aspartat kedua sebagai penstabil keadaan transisi. Enzim ini juga memiliki domain katalitik berbentuk (????/????)8-barrel dan conserved sequence regions (CSRs) yang khas. Berdasarkan kemiripan urutan dan fungsi biokimia, GH13 terbagi menjadi 49 subkeluarga, salah satunya adalah GH13_45. Beberapa anggota GH13_45 yang telah dipelajari adalah AmyA, Gt-amyII, ASKA, ADTA, BaqA, dan BmaN1. BmaN1, ?-amilase dari Bacillus megaterium NL3, memiliki kemampuan untuk mendegradasi pati mentah. Anggota subkeluarga GH13_45 mampu menghidrolisis pati mentah tanpa domain pengikat pati (starch-binding domain, SBD), sehingga diperkirakan memiliki mekanisme alternatif melalui surface binding sites (SBS). Hasil kajian bioinformatik menunjukkan bahwa BmaN1 memiliki dua keunikan dibandingkan dengan kebanyakan amilase dari subkeluarga GH13_45, yaitu keberadaan ujung domain C yang kaya dengan residu aromatik lestari dan triad katalitik termodifikasi yang terdiri atas Asparta–Glutamat–Histidin menggantikan Aspartat–Glutamat–Aspartat. Penelitian ini bertujuan untuk mengkaji peran 45 residu ujung domain C BmaN1 terhadap aktivitas dan kestabilan enzim, serta mempelajari residu Asp203, Glu231, His294, dan Lys202 yang terdapat pada kantung katalitik BmaN1. Penelitian dilakukan melalui pendekatan eksperimen yang meliputi ekspresi, pemurnian, serta karakterisasi biokimia BmaN1 dan BmaN1?C, serta konstruksi mutan katalitik BmaN1?C (Asp203Ala, Glu231Gln, His294Asp, Lys202Ala, dan Lys202Asp). Di sisi lain, pendekatan in silico melibatkan pemodelan struktur tiga dimensi, penambatan substrat analog akarbosa, serta simulasi dinamika molekul untuk memahami dampak mutasi terhadap interaksi enzim-substrat. BmaN1 diekspresikan dalam bentuk badan inklusi dengan ukuran sekitar 56 kDa, sedangkan BmaN1?C (~49 kDa) lebih banyak ditemukan pada fraksi terlarut. Pemurnian melalui kromatografi afinitas Ni-NTA menghasilkan protein dengan aktivitas spesifik 1,54 ± 0,23 U/mg untuk BmaN1 yang sudah mengalami pelipatan ulang dan 1,69 ± 0,16 U/mg untuk BmaN1?C. Kedua enzim memiliki pH dan suhu optimum yang sama (pH 6,5 dan 50 °C), aktif pada rentang pH 4,5–9,5, serta stabil pada suhu 40–80 °C. Uji degradasi pati mentah menunjukkan bahwa BmaN1 mampu mengadsorpsi pati jagung dan singkong dengan tingkat adsorpsi masing-masing 34% dan 41%. Jumlah gula pereduksi yang dihasilkan BmaN1 dalam menghidrolisis pati mentah jagung dan singkong adalah 6,92 ± 2,30 mM dan 8,02 ± 1,71 mM, dengan persen derajat hidrolisis masing-masing sebesar 3,1% dan 3,6%. Sebaliknya, BmaN1?C tidak mampu mengadsorpsi pati mentah, meskipun tetap aktif terhadap pati larut. Hal ini menunjukkan bahwa 45 residu C-terminal berperan penting dalam interaksi dengan granula pati. Karakterisasi lebih lanjut memperlihatkan bahwa BmaN1?C lebih stabil daripada BmaN1. Setelah inkubasi 4 jam pada kondisi optimum, BmaN1?C mempertahankan 83% aktivitas, sedangkan BmaN1 hanya 50%. Selain itu, baik BmaN1 maupun BmaN1?C memiliki 60% aktivitas terhadap SDS dan EDTA hingga konsentrasi 2,5 mM. Parameter kinetik kedua enzim menunjukkan bahwa BmaN1 memiliki nilai kcat/KM 1,3 lebih tinggi dibandingkan BmaN1?C. Hasil penelitian ini mengungkap bahwa keberadaan 45 residu asam amino di ujung domain C BmaN1 berperan penting dalam afinitas pengikatan, efisiensi degradasi pati, dan kestabilan enzim. Pemodelan struktur tiga dimensi menunjukkan bahwa BmaN1?C mempertahankan kerangka domain A, B, dan C khas ?-amilase. Superimposisi dengan GTA (PDB: 4E2O) menunjukkan kesamaan spasial residu katalitik, meskipun Asp203 bergeser ke posisi i+1, Glu231 menempati posisi donor proton, dan His294 menggantikan Asp konservatif sebagai penstabil transisi. Mutasi residu pada kantung katalitik menghasilkan dampak signifikan terhadap aktivitas BmaN1?C. Mutan Asp203Ala dan Glu231Gln kehilangan seluruh aktivitas enzimatis. Hasil ini menunjukkan peran Asp203 sebagai nukleofil dan Glu231 sebagai donor proton. Mutasi His294Asp menurunkan aktivitas hingga 80% yang menunjukkan bahwa His294 berfungsi sebagai penstabil keadaan transisi menggantikan peran Asp pada ?-amilase GH13 lain. Mutan Lys202Ala mempertahankan 45% aktivitas, sedangkan Lys202Asp kehilangan seluruh aktivitas, menegaskan peran Lys202 dalam menjaga konformasi kantung pusat aktif. Hasil eksperimen ini membuktikan peran Asp203–Glu231–His294 sebagai triad katalitik serta keterlibatan Lys202 dalam mendukung orientasi residu katalitik. Penambatan akarbosa menunjukkan interaksi erat antara residu pada kantung katalitik dengan ligan, dengan jarak ikatan hidrogen dan interaksi elektrostatis dalam kisaran yang relevan. Selanjutnya, simulasi dinamika molekul dilakukan pada model struktur BmaN1?C dan varian mutan untuk mengevaluasi dampak perubahan struktural akibat mutasi residu katalitik terhadap kinerja enzim. Mutasi Asp203Ala dan Glu231Gln diperkirakan menghilangkan kemampuan enzim untuk menyerang karbon anomerik dan melakukan protonasi terhadap ikatan glikosidik, sehingga reaksi hidrolisis pati tidak berlangsung. Mutasi His294Asp menyebabkan terganggunya jarak ikatan hidrogen, disertai pergeseran posisi residu-residu katalitik menuju lokasi +1 dan +2 dari ikatan glikosidik pati, yang berdampak pada penurunan efisiensi katalitik. Mutasi Lys202Ala masih terdapat aktivitas parsial karena konfigurasi triad katalitik tetap terjaga, sedangkan substitusi dengan asam amino bermuatan negatif seperti aspartat (Lys202Asp) mengganggu aktivitas secara signifikan. Perubahan muatan residu dari positif ke negatif, serta perbedaan ukuran dan orientasi rantai samping, diduga mengganggu posisi residu dan distribusi muatan di sekitar sisi katalitik, sehingga memengaruhi substrat menjauhi sisi katalitik. Secara keseluruhan, penelitian ini memberikan beberapa sumbangan pengetahuan mengenai struktur dan fungsi ?-amilase subkeluarga GH13_45, khususnya BmaN1 dari Bacillus megaterium NL3. Pertama, ujung domain C BmaN1 berperan penting dalam adsorpsi dan degradasi pati mentah, kemungkinan melalui surface binding sites yang tersusun atas residu aromatik. Kedua, BmaN1 memiliki komposisi triad katalitik yang unik Asp-Glu-His, dengan His294 menggantikan Asp konservatif sebagai penstabil transisi. Hal ini menunjukkan adanya variasi mekanisme katalisis di subkeluarga GH13_45 yang belum banyak dilaporkan. Kombinasi keunikan domain C-terminal dan triad katalitik atipikal tidak hanya penting untuk pemahaman dasar biokimia enzim, tetapi juga membuka peluang aplikasi bioteknologi yang lebih luas dalam pengolahan pati, produksi bioenergi, maupun industri pangan.