Perpustakaan Digital ITB

Cartilage Oligomeric Matrix Protein, COMP adalah suatu protein asam pentamerik non-kolagen yang terdapat pada matriks ekstraseluler dalam tulang rawan. Kegunaan klinis COMP adalah sebagai biomarker yang digunakan untuk memantau kemajuan proses pengobatan pada degenerasi tulang rawan terutama osteotritis (OA). Metode yang sudah dikembangkan untuk deteksi dan kuantifikasi COMP dari cairan sinovial, darah, dan urin adalah dengan immunoassay (ELISA, ECLIA dan ELFA). Walaupun kuantifikasi COMP dengan metode ELISA memiliki sensitivitas yang baik, masih menimbulkan masalah positif palsu yang tinggi berdampak sulit membedakan kadar COMP pada pasien artritis dan trauma akut kemudian terjadi ketidakbermaknaan nilai interpretasi pengukuran. Kondisi lain adalah mahalnya antibodi dan baku standar COMP sebagai antigen serta memiliki masa simpan yang pendek dan mudah rusak. Dengan demikian, penting mengembangkan metode alternatif ekstraksi COMP disertai pengembangan metode analisis COMP yang sederhana seperti spektrofotometri. Pada awal COMP ditemukan, para peneliti mengekstraksi COMP dari tulang rawan binatang dan tulang rawan manusia dalam larutan mengandung EDTA atau heparin dengan yield yang memadai dari sampel yang melimpah. Namun, pada kondisi ketersediaan sampel yang terbatas seperti darah dan urin adalah tidak memungkinkan untuk memperoleh yield yang representatif. Diperlukan inovasi ekstraksi yang mampu mengikat sekaligus memekatkan secara efisien. Upaya pengikatan sekaligus pemekatan protein kadar rendah pada sampel banyak dilakukan menggunakan adsorben partikel magnetik. Preparasi partikel magnetit yang diperkaya EDTA disintesis menggunakan metode elektrokimia secara cepat dan efisien telah dilaporkan peneliti lain bahwa partikel ini memiliki kristalinitas yang paling baik saat diproduksi skala kecil. Bila adsorben magnetik diproduksi dalam skala menengah untuk memperoleh jumlah partikel lebih banyak, maka diperlukan optimasi metode sintesis partikel magnetik yang diperkaya EDTA secara elektrokimia. Pemanfaatan adsorben magnetit yang diperkaya EDTA (magnetit@EDTA) saat ekstraksi fasa padat protein dalam sampel urin, terbukti dapat memekatkan protein ii globular sebanyak 27% dalam waktu cepat termasuk di dalamnya kelompok metalloprotein. Begitu pun albumin dalam urin turut terikat pada adsorben. Konsentrasi albumin di dalam urin lebih rendah daripada di dalam darah dan cairan sinovial, oleh karena itu penting menguji interferensi albumin pada saat ekstraksi COMP dari sampel cairan biologis. Masalah selanjutnya, karena titik isoelektrik albumin (pI=4,0) dan protein COMP (pI=4,2) berdekatan akan berpotensi samasama terikat lemah pada partikel magnetit@EDTA pada saat ekstraksi, namun hal ini akan dapat dipecahkan dengan teknik pemisahan protein berdasarkan berat molekul. Tujuan penelitian ini adalah melakukan optimasi sintesis magnetit@EDTA sebagai adsorben pengikat agar memiliki kemurnian fasa magnetit dan kristalinitas baik dalam skala produksi menengah. Selanjutnya, melakukan studi adsorpsi COMP murni pada partikel magnetit@EDTA dan menemukan model adsorpsi isoterm yang paling baik. Proses uji coba aplikasi ekstraksi COMP pada sampel dilakukan pada tulang, sedangkan untuk menyimulasikan gangguan albumin pada ekstraksi dan analisis COMP secara spektrofotometri digunakan sampel buatan sebelum diaplikasikan pada sampel darah dan cairan sinovial. Sintesis magnetit@EDTA dimulai dengan pengaturan perangkat elektrokimia. Katoda baja stainless kelas 316L 2B ditempatkan di tengah berjarak 5-7 cm dari anoda karbon grafit. Katoda ditempatkan di antara dua anoda dalam sebuah bak berisi cairan elektrolit menggandung disodium EDTA dan besi. Serbuk EDTA lebih dahulu dilarutkan sebelum besi (rasio Fe (III) dan Fe (II) 1:2), pH 4-7. Catu daya diatur pada densitas arus 10 mA/menit pada katoda ukuran 8 cm x 5 cm selama 10 – 15 menit pemberian arus listrik 400 mA sampai terbentuk deposit hitam. Setelah diberikan arus listrik dari catu daya, suhu meningkat lebih dari 25 °C dalam larutan elektrolit menyebabkan magnetit dan hematit pada katoda menjadi sulit terdeposit. Upaya mengurangi terbentuknya fasa pengotor hematit dan memaksimalkan produk utama magnetit, dilakukan pengendalian temperatur dengan cara menurunkan suhu sampai dibawah 10?, sehingga proses elektrokimia dilakukan di dalam ruang dingin. Analisis FT-IR magnetit@EDTA menunjukkan vibrasi kuat untuk gugus karbonil (C=O) pada bilangan gelombang 1625 cm-1 , polietilen (-CH2) pada bilangan gelombang 2947 cm-1, dan besi oksida (FeO) pada bilangan gelombang 590 cm-1. Hasil analisis XRD menunjukkan kristalinitas baik sebesar 68%, kemurnian fasa magnetit 98% dibandingkan pada acuan baku bahan International Centre for Diffraction Data (ICCD). Ukuran partikel dengan particle size analyzer menunjukkan ukuran submikron antara 4000 – 10.000 nm. Hasil analisis SEM, partikel menunjukkan bentuk partikel amorf. Hasil uji histeresis magnetik skala sedang dan membentuk sigmoid sebagaimana partikel magnetit pada umumnya. Studi adsorpsi COMP pada magnetit@EDTA dilakukan pada suhu ruang. Indikator capaian dilihat dari nilai koefisien regresi yang paling tinggi pada adsorpsi isoterm. Nilai R2 Freundlich, Temkin, dan Langmuir secara berurutan antara lain 0,992741, 0,957649, dan 0,952107. Proses adsorpsi COMP pada partikel magnetit@EDTA berjalan maksimal selama 1 jam homogenisasi di dalam larutan penyangga fosfat iii pH 7,4 pada suhu 20 – 25 °C. Nilai konstanta Freundlich 0,016391 menjelaskan bahwa interaksi antara adsorben dan protein adalah adsorpsi multilayer. Fenomena COMP terikat pada permukaan adsorben secara heterogen menyatakan bahwa distribusi COMP tak seragam, berlapis-lapis terikat di permukaan adsorben. Adapun frekuensi penggunaan ulang atau reusability adsorben untuk mengikat COMP adalah sebanyak 1 kali pakai terhadap sampel. Hasil unjuk kerja uji gangguan albumin pada sampel buatan (albumin serum dan COMP) yang ditetapkan dengan metode ELISA. Hasil perolehan kembali COMP 105,8% memenuhi persyaratan mutu Clinical Laboratory Standard Institute (CLSI) yaitu 90 – 110%. Analisis COMP pada sampel tulang rawan ditetapkan dengan dua metode yaitu ELISA sebagai pembanding dan metode spektrofotometri UV sebagai metode diuji. Unjuk kerja metode spektrofotometri menunjukkan nilai LoB 0,002 ng/ml, nilai LOD dan LOQ berurutan 0,091 ng/ml dan 0,876 ng/ml. Hasil uji perbandingan dengan metode ELISA menunjukkan nilai koefisien regresi 0,9916 mendekati standar CLSI yaitu koefisien regresi >0,9985. Sintesis partikel magnetit@EDTA metode elektrokimia berlangsung optimal dalam temperatur rendah. Adsorben memiliki karakteristik material yang terstandar industri. Mekanisme adsorpsi isoterm COMP pada magnetit@EDTA menunjukkan model adsorpsi isoterm Freundlich sehingga protein secara elektrostatik terikat lemah. Sifat ini tentu saja memudahkan proses desorpsi adsorbat COMP dari adsorben dengan mengambil alih ikatan elektrostatik oleh larutan ionik yang lebih kuat seperti NaCl pekat. Pengembangan metode analisis COMP secara spektrofotometri menunjukkan unjuk kerja kompatibilitas yang memenuhi persyaratan mutu analitis dari CLSI pada sampel tulang rawan sekalipun albumin sebagai pengganggu hadir di dalam ekstrak sampel. Di masa datang, adsorben magnetit@EDTA dapat dimanfaatkan sebagai platform pra perlakuan pemekatan sampel cepat sebelum analisis kuantitatif spektrofotometri UV atau analisis kuantitatif COMP dari sampel cairan biologis seperti darah dan cairan sendi.