Perpustakaan Digital ITB

Sistem imun Aves memiliki molekul reseptor yang mengenali pathogen-associated molecular pattern (PAMP) berupa Toll-like Receptor (TLR) sebagai pertahanan pertama untuk pengenalan patogen. Pada ayam, TLR21 dapat mengenali Cytosine-phosphate-guanosine oligodeoxynucleotides (CpG-ODN), suatu motif CpG yang tidak termetilasi pada DNA bakteri. Salah satu bakteri patogen yang menginfeksi ayam dan mengakibatkan kerugian besar pada peternakan unggas adalah Salmonella enterica subsp. enterica serovar Enteritidis (Salmonella Enteritidis (SE)), yang juga banyak menimbulkan sakit pada manusia. Telur dan daging ayam yang terkontaminasi Salmonella dapat menjadi sumber penyebab foodborne disease pada manusia, sehingga pengendalian Salmonella di peternakan unggas merupakan salah satu strategi internasional yang ditetapkan untuk mencegah foodborne disease. Penularan SE dapat melalui transmisi transovarian, yang berawal dari kolonisasi SE di oviduk kemudian menuju ovarium. Penelitian in vivo menggunakan ayam dengan perlakuan intravaginal untuk meniru transmisi transovarian pada ayam belum banyak dilaporkan, khususnya pada ayam lokal Indonesia. Penelitian menggunakan ayam lokal Indonesia penting dilakukan, seiring dengan program Bedah Kemiskinan Rakyat Sejahtera (Bekerja) yang dicanangkan Pemerintah RI, salah satunya dengan membagikan ayam Kampung Unggul Balitbangtan (KUB)-1 sebagai ayam lokal Indonesia galur unggul berdasarkan SK Mentan RI No. 274/kpts/SR.120/2/2014. Penelitian ini bertujuan untuk mempelajari potensi CpG-ODN yang diberikan secara intravaginal dalam menstimulasi respons imun inang, melalui interaksi dengan TLR21 untuk memodulasi AvBD10, yang melibatkan peran sitokin pro-inflamasi IL1B dan sitokin anti-inflamasi IL10, pada ovarium dan oviduk ayam KUB-1. Diharapkan CpG-ODN yang diberikan secara intravaginal dapat bermanfaat sebagai alternatif pencegahan Salmonellosis transovarian. Penelitian dikerjakan dalam tiga tahap. Tahap I dilakukan karakterisasi molekuler dan analisis filogenetika TLR21 ayam KUB-1. Gen TLR21 diperoleh dari hasil ekstraksi RNA ovarium yang digunakan untuk memperoleh cDNA dengan transkripsi terbalik. Urutan asam nukleat TLR21 diperoleh melalui sequencing, dengan menggunakan tiga pasang primer yang didesain berdasarkan TLR21 Gallus gallus (NM_001030558.3). Urutan asam nukleat dari tiga fragmen gen TLR21 dianalisis menggunakan perangkat bioinformatika. Tahap II merupakan penelitian in vivo yang dilaksanakan di Balai Veteriner Subang dengan fasilitas BSL2+ dan insinerator, sebagaimana saran Komisi Etik ITB No. 01/KEPHP-ITB/3-2019. Sebanyak 39 ekor ayam KUB-1 betina, umur 60 minggu, dibagi menjadi empat kelompok (T1, T2, T3, dan C). Kelompok T1 diberi GpG-ODN secara intravaginal, kelompok T2 diberi SE secara intravaginal, kelompok T3 diberi CpG-ODN secara intravaginal dan uji tantang SE secara intravaginal, dan kelompok C sebagai kontrol hanya diberi PBS secara intravaginal. Pemberian CpG-ODN dalam sediaan 5 ?g CpG-ODN/ 500 ?l PBS. Pemberian SE secara intravaginal dalam sediaan 5x107 CFU. Pada hari ke-1 sampai hari ke-4 pasca intravaginal (PI) dilakukan nekropsi untuk pengambilan sampel jaringan. Selanjutnya deteksi koloni SE pada ovarium dan oviduk melalui uji isolasi dan biokimia Salmonella dan PCR gen prot6E, analisis cemaran mikrob melalui Total Plate Count (TPC), dan analisis level ekspresi AvBD10 melalui reverse transcription real-time qPCR (RT qPCR). Pada penelitian tahap III dilakukan analisis terhadap level ekspresi gen TLR21, IL1B, AvBD10, dan IL10. Data level ekspresi gen diolah menggunakan rumus 2-??Ct, yang kemudian dilanjutkan dengan analisis statistik. Hasil penelitian tahap I, diperoleh cDNA TLR21 ayam KUB-1 yang disusun oleh 3504 nukleotida, termasuk 2823 pb open reading frame (ORF), yang mengkode protein putatif 940 asam amino. Protein TLR21 ayam KUB-1 memiliki domain ekstraseluler yang mengandung 20 LRR, domain transmembran, dan domain intraseluler TIR dengan sisi aktif pada residu 847. Protein putatif TLR21 ayam KUB-1 memiliki homologi 99,89% terhadap TLR21 ayam broiler (NP_001025729.3). Pohon filogenetika Neighbor Joining menginformasikan bahwa TLR21 ayam KUB-1 dalam satu klaster dengan TLR21 Gallus gallus berbagai galur ayam, dan TLR21 Aves berbeda klaster dengan TLR21 Pisces, di mana TLR21 Aves terdiferensiasi menjadi subklaster TLR21 ayam dan subklaster TLR21 unggas selain ayam (itik dan angsa) yang membentuk hubungan parafiletik. Pada penelitian tahap II, melalui uji isolasi dan biokimia Salmonella pada ayam KUB-1 yang diberi SE 5x107 CFU secara intravaginal, semua sampel ovarium dan oviduk dinyatakan negatif Salmonella, sedangkan pada kultur K(+) terdeteksi koloni Salmonella. Berdasarkan analisis statistik One-way ANOVA, pemberian SE 5x107 CFU secara intravaginal terbukti meningkatkan jumlah mikrob pada ovarium ayam KUB-1 signifikan (P?0,05), namun jumlah mikrob di bawah ambang cemaran. Secara keseluruhan ovarium dan oviduk ayam KUB-1 tidak mengandung cemaran mikrob. Selanjutnya berdasarkan analisis statistik One-way ANOVA, pemberian SE 5x107 CFU secara intravaginal meningkatkan level ekspresi AvBD10 pada kelompok T2, sedangkan pada kelompok T3 terjadi peningkatan level ekspresi AvBD10 secara signifikan pada ovarium (P ?0,01) dan pada oviduk (P?0,05). Pada tahap III, berdasarkan uji One-way ANOVA diketahui bahwa CpG-ODN yang diberikan secara intravaginal terbukti meningkatkan level ekspresi TLR21 dan AvBD10 secara signifikan (P?0,05) dan meningkatkan level ekspresi IL1B dan IL10 pada ovarium dan pada oviduk ayam KUB-1 secara resiprokal. Kesimpulan dari peneltian ini adalah bahwa di sepanjang evolusi TLR21 pada ayam, karakter molekuler TLR21 masih dilestarikan sehingga pada ayam KUB-1 tidak jauh berbeda dari ayam broiler. Namun terhadap itik dan angsa telah terjadi evolusi, meskipun fungsinya masih sama. Fungsi pengenalan TLR21 terhadap CpG-ODN dapat memicu respons imun bawaan yang dapat melawan bakteri SE. Interaksi CpG-ODN – TLR21 menstimulasi respons imun bawaan melalui peran sitokin pro-inflamasi IL1B untuk meningkatkan regulasi ekspresi AvBD10 bagi pertahanan inang. Peningkatan level ekspresi sitokin anti-inflamasi IL10 mengindikasikan perannya dalam meredakan inflamasi. Berdasarkan kemampuannya menginduksi AvBD10 melalui pengaktifan TLR21 yang menstimulasi peran resiprokal IL1B dan IL10, maka pemberian CpG-ODN secara intravaginal memiliki potensi untuk dikembangkan sebagai salah satu metode pencegahan Salmonellosis transovarian pada ayam usia produktif bertelur.