Perpustakaan Digital ITB

Salah satu metode pemurnian protein rekombinan yang paling sering digunakan adalah kromatografi kolom afinitas. Protein dapat dimurnikan dengan kolom afinitas nikel setelah difusikan dengan residu polihistidin pada ujung amino atau ujung karboksinya. Penentuan posisi fusi polihistidin pada protein rekombinan bergantung letak sisi aktif atau domain penting protein tersebut. pET-16b merupakan salah satu vektor ekspresi yang memfasilitasi fusi protein target dengan polihistidin pada ujung amino. Penelitian ini bertujuan untuk merekonstruksi pET-16b dengan mutagenesis situs terarah berbasis PCR (PCR SDM) menjadi pET-16b_rec sehingga memungkinkan fusi protein dengan polihistidin pada ujung karboksi. Pada penelitian ini kondisi PCR untuk mutasi terarah dioptimasi, yang meliputi suhu penempelan primer, waktu penempelan primer, waktu pemanjangan produk PCR, dan jenis enzim polimerase yang digunakan. Hasil SDM direaksikan dengan DpnI 10 U, diligasi dan ditransformasi ke E. coli TOP10. Plasmid hasil transformasi dikarakterisasi dan ditentukan urutan basa nukleotidanya. Koreksi urutan basa nukleotida pET-16b_rec yang belum sesuai dilakukan dengan metode SDM-SPRINP. Produk yang dihasilkan direaksikan dengan DpnI 30 U, ditransformasi ke E. coli TOP10, kemudian dianalisis kebenaran urutan basa nukleotidanya. Kondisi PCR SDM paling optimal didapatkan pada suhu penempelan 68 °C selama 10 detik dan waktu pemanjangan selama 4 menit. Pemakaian Q5 HiFi Polimerase menghasilkan produk dengan jumlah lebih tinggi dibanding kedua enzim lainnya. Suhu penempelan primer optimal untuk SDM-SPRINP yaitu 60 °C, dengan siklus PCR sebanyak 30 siklus. pET-16b_rec berhasil dikonstruksi dengan ukuran 5684 pb dan memiliki urutan basa nukleotida yang diinginkan.