Perpustakaan Digital ITB

Protein rekombinan merupakan protein hasil rekayasa genetik yang saat ini banyak digunakan untuk keperluan medis, pangan, industri, dan pengembangan ilmu. Protein ini dihasilkan melalui ekspresi gen di dalam sel inang yang berupa bakteri, ragi, sel mamalia, sel serangga ataupun sel tumbuhan. Ekspresi gen pengode protein manusia di dalam sel bakteri memiliki kekurangan karena hasil proteinnya rendah, terbentuk inclusion body, dan tidak adanya modifikasi pasca-translasi. Di lain sisi, ekspresi gen pengode protein manusia di dalam sel hewan, sel tumbuhan, maupun sel serangga membutuhkan biaya yang tinggi serta waktu pengerjaan yang lama. Pada penelitian ini, plasmid pMHPBF-ITBe diuji potensinya sebagai vektor ekspresi dalam sistem ekspresi ragi metilotropik Hansenula polymorpha DL-1 ura::zeo dan kitosanase rekombinan (Csn1) dari Bacillus amyloliquefaciens ABBD digunakan sebagai model protein. H. polymorpha dipilih karena memiliki modifikasi pasca-translasi, bersifat termotoleran, dan biaya produksi yang terjangkau. Pada tahap awal, sepasang primer telah didesain dan digunakan untuk mengamplifikasi gen pengode Csn1. Hasil amplifikasi ini diklon ke vektor pGEM-T Easy lalu disubklon ke vektor pMHPBF-ITBe. Konfirmasi keberhasilan kloning dan subkloning dilakukan dengan analisis enzim restriksi, PCR koloni, dan sekuensing. Hasil sekuensing menunjukkan bahwa plasmid pGEM-T-csn1 dan pMHPBF-ITBe-csn1 telah berhasil dikonstruksi dengan urutan nukleotida yang sesuai dengan urutan gen pengode Csn1. Plasmid rekombinan pMHPBF-ITBe-csn1 kemudian digunakan untuk mentransformasi H. polymorpha DL-1 ura::zeo melalui rekombinasi homolog dan keberhasilan transformasi diverifikasi kembali dengan PCR koloni. Transforman yang positif kemudian digunakan untuk mengekspresikan gen csn1. Kitosanase (Csn1) hasil ekspresi memiliki ukuran ±30 kDa pada gel elektroforesis SDS-PAGE dan aktivitas hidrolisis spesifik sebesar 497 U/mg terhadap substrat kitosan. Dengan demikian, plasmid pMHPBF-ITBe dapat digunakan sebagai vektor ekspresi dalam sistem ekspresi dalam H. polymorpha DL-1 ura::zeo.