Perpustakaan Digital ITB

Resistensi antibiotik pada Mycobacterium tuberculosis (Mtb) terus meningkat secara global. Kondisi ini menuntut pengembangan strategi baru dalam penemuan obat anti-tuberkulosis (OAT). Salah satu target potensial adalah two-component system PhoPR, yang berperan penting dalam regulasi virulensi dan persistensi Mtb. Penargetan sistem ini, khususnya domain sitoplasmik PhoR (SitoPhoR), berpotensi menghasilkan obat yang dapat melemahkan Mtb. Penelitian sebelumnya telah mengembangkan Dimer-based Screening System (DBSS) yang menargetkan SitoPhoR untuk menapis senyawa yang mampu menginhibisi dimersiasi protein tersebut. Sistem ini memiliki kelemahan yakni, ketidakmampuannya untuk mengamati interaksi langsung antara SitoPhoR dan senyawa uji, maka diperlukan metode lain untuk mengonfirmasinya. Oleh karena itu, penelitian ini bertujuan untuk melakukan subkloning dan ekspresi DNA pengkode SitoPhoR guna memperoleh protein SitoPhoR murni yang dapat digunakan untuk mengonfirmasi interaksi langsung antara SitoPhoR dan senyawa uji. DNA pengkode SitoPhoR akan diisolasi menggunakan polymerase chain reaction (PCR) dari plasmid pAraC-PhoR dan disisipkan ke dalam vektor pET23a(+) menggunakan situs restriksi XhoI dan NdeI. Kedua fragmen akan disambungkan menggunakan T4 DNA ligase untuk membentuk plasmid ekspresi pET23a(+)_SitoPhoR Mtb (~4151 bp). Keberhasilan konstruksi plasmid dikonfirmasi melalui PCR koloni hasil transformasi, PCR Plasmid, dan sekuensing DNA. Ekspresi protein dilakukan pada suhu 37 °C dengan agitasi 150 rpm selama 4 jam, baik dengan maupun tanpa penambahan 1 mM inducer Isopropyl ?-D-1- thiogalactopyranoside (IPTG). Sel dipecahkan dengan sonikasi, dipisahkan menggunakan sentrifugasi, dan dianalisis dengan Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Plasmid ekspresi berhasil dikonstruksi dan DNA pengkode SitoPhoR menunjukkan tingkat kesesuaian sekuens sebesar 100%. Protein rekombinan (~21,5 kDa) berhasil diekspresikan baik dengan maupun tanpa penggunaan inducer. Namun, protein ini hanya terdeteksi dalam fraksi tidak terlarut, menandakan terjadinya misfolding dan pembentukan badan inklusi. Pada penelitian ini DNA pengkode SitoPhoR berhasil disubkloning dan diekspresikan, namun diperlukan penelitian lanjutan untuk meningkatkan kelarutan protein. Keberhasilan ekspresi SitoPhoR Mtb, memungkinkan dilakukannya studi terkait struktur dan fungsinya, membuka jalan bagi upaya penemuan obat baru untuk melawan tuberkulosis.