Article Details

SUBKLONING GEN SINTETIK CGTASE ALFA DARI THERMOCOCCUS SP. B1001 KE PET16B DAN KARAKTERISASI PRODUK EKSPRESINYA DI ESCHERICHIA COLI BL21(DE3)

Oleh   Siti Azizah Kharisnaeni [20712041]
Kontributor / Dosen Pembimbing : Dr. rer. nat. Catur Riani, S.Si., M.Si.; Prof. Dr. Debbie Soefie Retnoningrum;
Jenis Koleksi : S2 - Tesis
Penerbit : SF - Farmasi
Fakultas : Sekolah Farmasi
Subjek :
Kata Kunci : gen cgtase alfa sintetik ,Thermococcus sp. B1001, Subkloning, pET16b, rCGTase sitoplasma dan periplasma
Sumber :
Staf Input/Edit : yana mulyana  
File : 1 file
Tanggal Input : 01 Jul 2022

CGTase adalah enzim yang mengkatalisis pcmbentukan siklodesktrin (CD) dari pati. CD banyak digunakan di bidang farmasi sebagai senyawa peningkat kelanitan, stabilitasdan bioavailabilitas serta penyamar rasa dan bau. Dengan meningkatnya kebutuhan CD, perlu diupayakan peningkatan produksi CGTase yang memiliki karakteristik unggul. Produksi CD skala industri menggunakan suhu yang tinggi, karenanya dibutuhkan CGTase yang termostabil. Di Laboratorium Bioteknologi Farmasi ITB telah berhasii dibuat CGTase alfa rekombinan (rCGTase a) yang dikode oleh gen cgtase alfa sintetik dari Thermococcus sp. B1001 untuk diproduksi di periplasma sel inang Escherichia coil BL21(DE3).Tingkat ekspresi gen tersebut pada vektor ekspresi pJexpress414 (pJx_cgtasealfa) sangat rendah. Penelitian ini bertujuan untuk melakukan subkloning gen cgtase alfa sintetik ke vektor pET16b sehingga diharapkan tingkat ekspresi gen cgtase alfa dapat lebih baik. Subkloning dilakukan untuk dua lokasi ekspresi gen secara terpisah yaitu di periplasma dan sitoplasma. Gen sintetik dari pJx cgtase_alla diamplifikasi dengan metode PCR secara terpisah dengan masing-masing pasangan primer spesifik sehingga diperoleh produk PCR berukuran 2264 pb (periplasma) dan, 2218 pb (sitoplasma). Produk PCR diligasikan kc vektor kioning pGEMT dan ditransformasi ke E. coil TOP10. Plasmid rekombinan yang diperoleh dinamakan pGEMT_cgt alfaperi dan pGEMT_cgt_a/fa_sito dan telah dIonfinriasi kebenarannya dengan analisis migrasi, pemotongandan PCR. Gen sintetik pada pGEMT rekombinan dipotong dengan enzim restriksi BarHI dan Ncoldan diligasikan ke vektor ekspresi pET16b yang dibuat linier dengan enzim yang sama. pET16b rekombinan (pET16bcgt_alfa_peri dan pET16b cgt_alfa_sito) ditransformasi ke coli TOP 10 dan dikonfirmasi kebenarannya. Protein rCGTase sitoplasma dan periplasma diproduksi di E. coil BL21(DE3) dengan induksi 0,1 ruM IPTG, suhu 25 °C selama 6 jam dan diperolah protein berukuran 80 kDa serta memiliki aktivitas hidrolisis pati. Isolasi protein rCGTase periplasma dilakukan pada skala 5 mL menggunakan kit dan protein dianalisis dengan SDS PAGE dan diuji aktivitas hidrolisis pati. Protein rCGTase sitoplasma diproduksi pada skala 100 mL dan sebagian besar didapatkan berada dalam berituk badan inklusi, sisanya dalam bentuk terlarut. Baik badan inklusi dan rCGTase 4oplasma yang terlarut memiliki aktivitas hidrolisis pati. Tingkat ekspresi gen cgtase alfa subkloning ke pET16b lebih tinggi 1,8 kali (sitoplasma) dan 1,1 kali (periplasma) dingkan tingkat ekspresinya pada pJexpress 414.