Perpustakaan Digital ITB
Senyawa organohalogen telah dimanfaatkan secara meluas sebagai pestisida,
herbisida, dan pelarut dalam industri. Penggunaan senyawa organohalogen secara
luas serta sifatnya yang beracun dan tidak mudah terurai mengakibatkan
penumpukan senyawa tersebut di lingkungan sebagai polutan. Banyak penelitian
telah melaporkan bahwa terdapat banyak mikroorganisme, terutama bakteri, yang
mampu mendegradasi senyawa organohalogen dan mengubahnya menjadi senyawa
yang tidak beracun dan aman bagi lingkungan. Salah satu metode yang banyak
dikembangkan untuk mengatasi dampak negatif dari senyawa organohalogen
dikenal dengan teknik bioremediasi. Bioremediasi pada umumnya memanfaatkan
kemampuan dari mikroorganisme dalam mengatasi permasalahan lingkungan.
Kemampuan degradasi organohalogen dimiliki oleh bakteri dikarenakan bakteri
tersebut dapat menghasilkan suatu enzim yang dinamakan dehalogenase.
Dehalogenase merupakan enzim yang mengkatalisis pemutusan ikatan antara atom
halogen dari senyawa induknya. Penelitian sebelumnya telah memberikan data
bahwa Pseudomonas aeruginosa strain lokal dari Indonesia memiliki kemampuan
dalam mendegradasi asam monokloroasetat. Gen yang mengkode haloacid
dehalogenase berukuran 702 bp, disebut sebagai paed-d, telah berhasil diklon ke
vektor pGEM-T dalam sel inang E. coli TOP10. Penelitian ini difokuskan untuk
subkloning gen paed-d ke vektor ekspresi pET-30a(+) dalam E. coli BL21 (DE3).
Primer maju dengan sisi pengenalan restriksi EcoRI, GAATTC, dan primer mundur
dengan sisi pengenalan restriksi HindIII, AAGCTT, digunakan pada proses PCR
untuk menghasilkan fragmen yang akan disubklon dengan orientasi ekspresi yang benar. Ururtan primer maju yang digunakan adalah 5’-
GAATTCATGCGCGCGATCCTGTTCGA-3’ sedangkan untuk primer mundur
adalah 5’-AAGCTTTCAGGCCGAGGCCGCCAGTT-3’. Amplikon yang
diperoleh diklon ke pGEM-T, ditransformasi ke E. coli TOP10, dikonfirmasi
melalui rePCR dan anlisis restriksi, disubklon ke pET-30a(+), dan ditransformasi
ke E. coli BL21 (DE3). Penggunaan primer ini telah berhasil memberikan
amplikon berukuran ~750 bp. Analisis restriksi dan rePCR mengkonfirmasi bahwa
amplikon tersebut adalah paed-d. Amplikon ini telah berhasil disubklon ke vektor
ekspresi pET-30a(+) dalam E. coli BL21 (DE3). Hasil penjajaran antara gen paedd
hasil subkloning dengan gen paed-d penelitian sebelumnya menunjukkan
kesamaan 100%. Overekspresi haloacid dehalogenase berdasarkan pengamatan
pada SDS-PAGE telah berhasil diperoleh dan terkonsentrasi pada debris sebagai
inclusion body. Ekspresi gen paed-d hasil rekombinan dengan IPTG sebagai
induser dianalisis dalam SDS-PAGE memberikan hasil terbaik pada konsentrasi
IPTG 0,01 mM dan suhu induksi 4 oC dengan ukuran protein sekitar 26 kD. Hasil
ini diperkuat oleh prediksi ukuran haloacid dehalogenase melalui Expacy
Protparam yang memberikan prediksi berat molekul haloacid dehalogenase dari
gen paed-d sebesar 26,352 kDa. Prediksi struktur tersier haloacid dehalogenase
Pseudomonas aeruginosa strain lokal berupa lipatan ?-sheet yang diapit oleh ?-
heliks. Analisa in silico memberikan jumlah residu 233 asam amino dengan
prediksi residu katalitik aspartat pada posisi residu nomor tujuh (Asp7)