Perpustakaan Digital ITB

Reverse transkriptase dari Avian myeloblastosis virus (AMV RTase) merupakan enzim yang digunakan untuk sintesis cDNA dari RNA. Enzim RTase umum digunakan pada reverse transcription real-time PCR (RT-qPCR). RT-qPCR banyak digunakan pada diagnosis infeksi oleh virus RNA dan studi ekspresi gen. Tujuan penelitian ini adalah untuk overproduksi enzim AMV RTase rekombinan, purifikasi enzim AMV RTase dan karakterisasinya menggunakan uji aktivitas. Overproduksi enzim AMV RTase dilakukan menggunakan inang Escherichia coli BL21-Codonplus (DE3)-RIPL. Optimasi overproduksi dilakukan pada variasi konsentrasi IPTG (0,5 dan 1 mM IPTG), suhu induksi (suhu 30°C dan 37°C), dan waktu induksi (4 dan 16 jam). Enzim AMV RTase dikarakterisasi menggunakan SDS-PAGE dan RT-qPCR. Hasil penelitian menunjukkan bahwa overproduksi optimal enzim AMV RTase pada E. coli BL21-Codonplus (DE3)-RIPL adalah pada kondisi induksi 1 mM IPTG, suhu 37°C, selama 4 jam. Enzim AMV RTase yang diproduksi pada kondisi ini dihasilkan dalam dalam bentuk tidak terlarut atau badan inklusi (BI). BI enzim AMV RTase berhasil disolubilisasi dalam dapar solubilisasi urea 6 M. Hasil solubilisasi kemudian dipurifikasi simultan renaturasi menggunakan kromatografi afinitas kolom nikel. Hasil purifikasi menunjukkan bahwa enzim AMV RTase berhasil dipurifikasi pada elusi dengan imidazol 1 M. Enzim AMV RTase murni kemudian diuji aktivitasnya menggunakan RT-qPCR. Hasil RT-qPCR menunjukkan adanya sinyal amplifikasi pada sampel RNA NnCoV hasil transkripsi in vitro. Hal ini menunjukkan bahwa AMV RTase yang diproduksi pada penelitian ini memiliki aktivitas, meskipun aktivitasnya belum setara dengan RTase pada kit komersial.