Perpustakaan Digital ITB

Latar Belakang : Virus Hepatitis B (HBV) menginfeksi lebih dari dua miliar orang dan 350 juta di antaranya terinfeksi secara kronis. Perkembangan infeksi HBV kronis menjadi kanker hati dipengaruhi antara lain oleh genotipe dan subgenotipe HBV, mutasi pada gen x dan kandungan DNA HBV. Untuk mengetahui adanya mutasi pada gen x, perlu dilakukan amplifikasi. Salah satu pendekatan yang dilakukan adalah dengan menggunakan metode nested PCR. Pada penelitian sebelumnya telah dilakukan nested PCR gen x HBV terhadap beberapa isolat klinik DNA dengan rentang titer sampel 10 5 -10 8 IU DNA/ml. Namun kondisi nested PCR yang digunakan tidak memberikan hasil untuk jenis sampel klinik yang tidak diketahui titernya.Tujuan penelitian ini adalah untuk mengoptimasi kondisi nested PCR gen x sampel klinik yang tidak diketahui titer DNA HBVnya, menentukan genotipe dan subgenotipe isolat klinik DNA serta keberadaan mutasi dari produk nested PCR. Metode : Nested PCR dilakukan dua tahap untuk mengamplifikasi gen x. Produk PCR pertama berupa fragmen berukuran teoritis 707 pb dan pada tahap kedua dihasilkan dua fragmen DNA yang masing-masing berukuran 469 pb (F1) dan 395 pb (F2). Optimasi yang dilakukan meliputi pemekatan sampel DNA menggunakan presipitasi alkohol, penurunan jumlah primer dan variasi pengenceran produk PCR pertama. Produk nested PCR yang didapatkan ditentukan urutan nukleotidanya dengan metode sekuensing dan dianalisis hasil pembacaannya dengan program BLAST untuk mendapatkan informasi genotipe, subgenotipe dan dengan program ClustalW untuk menentukan keberadaan mutasi. Hasil : Optimasi yang berhasil dilakukan adalah dengan pemekatan sampel DNA hingga mencapai konsentrasi 1000 µg/ml, penurunan jumlah primer semula 40 µM menjadi 20 µM dan variasi pengenceran produk PCR tahap pertama semula 100X menjadi 25X dan 10X. Sebanyak 14 sampel klinik dari 28 sampel telah berhasil diamplifikasi menggunakan kondisi yang dioptimasi. Sampel yang disekuensing sebanyak 10 sampel dengan hasil analisis sebanyak 5 sampel bergenotipe B (subgenotipe B2 dan B3) dan 5 sampel bergenotipe C (subgenotipe C1 dan C5). Analisis mutasi gen x terhadap hasil pensejajaran DNA terdapat satu mutasi terkait karsinoma hati (C1653T) dan ditemukan mutasi baru. Mutasi yang terkait karsinoma menyebabkan perubahan kodon pengkode asam amino histidin menjadi tirosin. Kesimpulan : Optimasi nested PCR terhadap isolat klinik yang belum diketahui titer DNA VHBnya berhasil meningkatkan persentase keberhasilan sebesar 50%. Dari 10 sampel klinik yang diujikan, sebanyak 5 sampel bergenotipe B (subgenotipe B2 dan B3) dan 5 sampel genotipe C (subgenotipe C1 dan C5) serta terdapat satu mutasi terkait karsinoma hati.