Perpustakaan Digital ITB

Reteplase rekombinan merupakan aktivator plasminogen rekombinan (rPA) turunan alteplase yang digunakan sebagai trombolitik untuk terapi infark miokardium akut. Reteplase telah disetujui oleh FDA dan EMA sejak tahun 1996. Harga reteplase tergolong tinggi dan belum pernah diproduksi maupun dipasarkan di Indonesia. Reteplase diproduksi di Escherichia coli dan cenderung membentuk badan inklusi karena memiliki sembilan ikatan disulfida. Tujuan penelitian ini adalah mengoptimasi proses produksi reteplase rekombinan terlarut menggunakan vektor ekspresi pET24b pada E. coli BL21(DE3), menguji aktivitas serta memurnikannya dengan kromatografi afinitas Ni-NTA. DNA sintetik pengkode reteplase hasil optimasi kodon dibawa oleh plasmid pET24b dan disebut sebagai pET24b_ret. Produksi reteplase dilakukan pada E. coli BL21(DE3) rekombinan yang membawa plasmid tersebut dengan dan tanpa plasmid chaperon pGroElDnaK. E. coli rekombinan dikonfirmasi kebenaran plasmid yang dibawanya melalui analisis pemotongan dan penentuan urutan DNA pengkode reteplase, GroEl dan DnaK. Optimasi kondisi overproduksi protein reteplase dilakukan dengan modifikasi suhu (20, 25, 37 dan 40°C), komposisi media Luria Bertani (LB dan ¼LB) serta keberadaan pGroElDnaK. Kultur diinduksi menggunakan isopropilthio--D-galaktosida dengan konsentrasi akhir 0,05 mM pada OD600 0,7- 0,8. Reteplase hasil overproduksi dikarakterisasi menggunakan SDS-PAGE dan dianalisa dengan perangkat lunak ImageJ. Aktivitas reteplase diuji dengan tPA human chromogenic activity assay. Reteplase bentuk terlarut dihasilkan 1,14 ± 0,01 mg/g sel basah dan memberikan aktivitas sebesar 45,97 UI/mg protein reteplase kasar pada kondisi produksi 20°C di E. coli rekombinan tanpa chaperon dalam media LB. Sedangkan reteplase bentuk tidak terlarut paling tinggi dihasilkan pada 37°C di E. coli rekombinan tanpa chaperon dalam media LB sebesar 19,6 ± 1,6 mg protein/g sel basah. Reteplase bentuk tidak terlarut berhasil dilarutkan dengan urea 8 M, DTT 0,1 M dalam dapar Tris-Cl 50 mM pH 8, memberikan aktivitas sebesar 1,53 UI/mg protein reteplase kasar, tetapi tidak dapat terikat di kolom Ni-NTA. Dengan demikian dapat disimpulkan bahwa reteplase dapat diproduksi dalam bentuk aktif menggunakan plasmid ekspresi pET24b_ret di E. coli BL21(DE3).