Perpustakaan Digital ITB

Penggunaan sistem seleksi antibiotik pada produksi protein terapeutik dapat diganti dengan sistem seleksi auksotrof lisin untuk menghindari risiko penyebaran resistensi antibiotik. Sistem seleksi auksotrof membutuhkan sel inang yang dimutasi salah satu gen pada kromosomnya dan plasmid yang membawa gen untuk mengkomplementasi sel inang mutan tersebut. Pada penelitian sebelumnya telah dikonstruksi plasmid yang membawa gen dapD untuk sistem seleksi auksotrof lisin. Salah satu cara untuk membuat inang mutan dapat digunakan metode CRISPR/Cas9 dan rekombinasi homolog λ-red. Metode ini melibatkan komponen endonuklease Cas9, sgRNA sebagai RNA penuntun, 20 nukleotida spesifik gen target (untuk dapD, N20dapD), protein rekombinase λ-red, serta fragmen homolog X1X2. Komponen tersebut terdapat dalam plasmid pCas dan seri pTarget, yaitu pTargetT-dapD dan pTargetF-dapD (untuk dapD). Tujuan penelitian ini adalah mengkonstruksi plasmid pTargetF-dapD, membuat E. coli BL21(DE3) mutan galur auksotrof lisin, serta mengkonfirmasi E. coli mutan yang didapatkan (E. coli BL21(DE3)dapD). Penelitian ini diawali dengan menentukan N20dapD dan fragmen homolog X1X2 secara in silico dilanjutkan dengan pemesanan gen sintetik yang membawa fragmen tersebut pada pUC18-N20dapDX1X2. Konstruksi pTargetF-dapD dilakukan dengan menyisipkan N20dapD ke pTargetF melalui situs restriksi EcoRI dan SpeI. Fragmen X1X2 diisolasi dengan metode PCR. Mutasi in vivo gen dapD dilakukan dengan mengelektroporasi pCas, menginduksi ekspresi protein rekombinase menggunakan L-arabinosa dengan konsentrasi akhir 10 mM, sebelum mengelektroporasi E. coli BL21(DE3) dengan seri plasmid pTarget. Plasmid dihilangkan melalui mekanisme curing dengan induksi IPTG (pTarget) dan perubahan suhu (pCas). pTargetF-dapD yang berukuran 2122 pb berhasil didapatkan dan dikonfirmasi melalui analisis migrasi, pemotongan EcoRI, PCR, dan penentuan urutan nukleotida. Fragmen X1X2 berhasil diisolasi dengan ukuran 953 pb. Transformasi dan curing kedua plasmid berhasil dilakukan. Sebanyak empat koloni E. coli mutan galur auksotrof lisin memberikan hasil positif pada analisis genotip melalui PCR dan secara fenotip melalui media seleksi. Dengan demikian penelitian ini berhasil mengkonstruksi pTargetF-dapD dan mendapatkan E. coli BL21(DE3)dapD mutan galur auksotrof lisin yang sudah terkonfirmasi kebenarannya.