Perpustakaan Digital ITB

Penyakit demam berdarah dengue disebabkan oleh infeksi virus dengue dari genus Flavivirus, family Flaviviridae. Virus dengue memiliki 4 serotipe, yaitu DENV-1, DENV-2, DENV-3 dan DENV-4 yang memiliki homologi genetik yang tinggi. Individu yang terinfeksi salah satu serotipe virus dengue akan membentuk kekebalan seumur hidup pada serotipe tersebut, tetapi tidak ada mekanisme perlindungan silang terhadap infeksi serotipe virus lainnya. Infeksi virus dengue pada manusia dapat menimbulkan manifestasi klinis yang berbeda mulai ringan hingga manifestasi klinis berat yang dikenal sebagai Dengue Hemorrhagic Fever (DHF) dan Dengue Shock Syndrome (DSS). Genom virus dengue merupakan RNA untai tunggal berukuran 11 kb yang mengkode tiga protein struktural (M, C, E) serta tujuh protein nonstruktural (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B dan NS5). Salah satu protein nonstrukstural yang penting pada virus dengue adalah protein NS1, yang berperan dalam pematangan dan replikasi RNA virus sehingga menjadi elemen penting dalam imunopatogenesis penyakit infeksi dengue. Sebagian besar kit diagnostik infeksi dengue yang tersedia didasarkan atas interaksi antara protein NS1 dengan antibodi anti NS1. Target jangka panjang dari penelitian ini adalah memproduksi protein rekombinan NS1 sebagai antigen untuk mendeteksi IgM/IgG pada serum darah atau mendeteksi keberadaan protein NS1 pada tahap awal infeksi virus dengue. Penelitian ini bertujuan untuk mempelajari ekspresi dan pemurnian protein DENV2-NS1 pada Pichia pastoris. Gen pengkode protein DENV2-NS1 diperoleh dari hasil sintesis secara komersial dan diinsersikan dalam plasmid pPICZα-A. Ekspresi protein DENV2-NS1 diregulasi oleh promotor AOX1 dan protein NS1 difusi dengan pre-pro-α faktor peptida sekuens untuk memfasilitasi sekresi protein ke media. Kaset ekspresi protein DENV2-NS1 terintegrasi pada lokus AOX1 kromosom P. pastoris melalui rekombinasi homolog single cross over. Transforman P. pastoris diseleksi kemampuan tumbuhnya pada media yang ii mengandung konsentrasi zeosin 500-2000 μg/mL untuk memperoleh transforman multi insersi. Salah satu transforman P. pastoris yang dinamakan P. pastoris KM71-4 dapat tumbuh pada media dengan konsentrasi zeosin 2000 μg/mL. P. pastoris KM71-4 kemudian digunakan untuk studi ekspresi protein DENV2-NS1. Ekspresi protein DENV2- NS1 dilakukan dengan penginduksi metanol sebesar 2% selama 72 jam pada suhu 30 °C. Protein rekombinan DENV2-NS1 yang diperoleh dimurnikan dengan kromatografi afinitas menggunakan resin Ni-NTA. Hasil SDS-PAGE menunjukkan pita protein berukuran ~43 kDa sesuai dengan jumlah residu asam aminonya. Evaluasi sifat antigen protein DENV2-NS1 rekombinan dengan kit diagnostik komersial menunjukkan bahwa protein DENV2-NS1 memiliki kemampuan untuk berinteraksi dengan antibodi monoklonal anti NS1. Berdasarkan hal yang telah diperoleh, maka protein rekombinan DENV2-NS1 yang dihasilkan dari penelitian ini potensial digunakan sebagai antigen untuk pengembangan kit dignostik demam berdarah.