Perpustakaan Digital ITB

Hepatitis B merupakan infeksi virus hepatitis B virus (HBV) yang dapat terjadi pada hati manusia dengan prevalensi rata-rata di Indonesia sebesar 2.1% serta prevalensi yang lebih tinggi pada Indonesia bagian timur. Salah satu metode untuk mendeteksi infeksi kronis hepatitis B merupakan deteksi Hepatitis B surface antigent (HBsAg) serum darah pasien menggunakan lateral flow assay atau ELISA. Akan tetapi, salah satu komponen penting untuk uji tersebut berupa antibodi sulit untuk diproduksi dalam skala besar. Teknologi rekombinan merupakan salah satu alternatif produksi antibodi skala besar, akan tetapi terdapat keterbatasan dengan teknologi rekombinan seperti modifikasi pasca translasi dan perbedaan sistem ekspresi prokaryot dengan sistem ekspresi eukaryot. Nanobodi merupakan salah satu alternatif antibodi yang cukup umum dikembangkan akhir-akhir ini. Nanobodi memiliki struktur yang lebih sederhana dibanding antibodi konvensional sehingga lebih mudah diekspresikan secara heterolog oleh organisme prokaryot. Salah satu tipe nanobodi yaitu variable novel antigent receptor (VNAR) dilaporkan memiliki memiliki beberapa keunggulan seperti solubilitas dan stabilitas yang lebih baik dibanding dengan nanobodi tipe lain. Oleh karena itu, penelitian ini dilakukan dengan tujuan untuk mendesain sistem ekspresi dan mengekspresikan VNAR Chiloscyllium plagiosum anti-HBsAg pada E.coli BL21(DE3). Adapun metode yang dilakukan adalah pendesainan gen sintetik menggunakan data sekuens asam amino VNAR HB17 anti HBsAg dari Chiloscyllium plagiosum yang diekspresikan pada E.coli BL21(DE3). Sebelum dilakukan desain gen sintetik, dilakukan karakterisasi hasil prediksi struktur protein. Berdasarkan analisis prediksi struktur VNAR yang dimiliki, didapati 1 ikatan disulfida kanonikal untuk membentuk struktur pengikat antigen yang stabil. VNAR HB17 juga diamati memiliki karakter hidrofilik yang kuat pada permukaan protein. Oleh karena itu, dilakukan penambahan signal peptide DsbA pada N terminal VNAR HB17 sehingga protein dapat membentuk jembatan disulfida kanonikal pada periplasma bakteri. Selain itu pula ditambahkan titik restriksi EcoRI di antara signal peptide dan gen VNAR HB17 sebagai spacer sequence dan tag hexahistidin untuk purifikasi protein. Konstruk insert yang didapatkan memiliki hasil sepanjang 412 bp dengan vektor pET-28a(+) sebagai backbone vektor ekspresi. Plasmid yang sudah disintesis dikloning pada bakteri E.coli DH5?. Plasmid yang dilinearisasi memiliki ukuran ±5600 bp, hasil ini sesuai dengan prediksi desain in silico. Setelah disekuensing, fragmen DNA pengkode VNAR HB17 hasil kloning terkonfirmasi tidak mengalami mutasi. Ekspresi VNAR pada E.coli BL21(DE3) dilakukan dengan menggunakan medium 2xYT selama 4 jam pada temperatur 37°C dan diinduksi dengan IPTG pada konsentrasi 0.25 mM. Protein total lalu diisolasi dari periplasma bakteri dan dianalisis dengan SDS-PAGE. Dapat diamati ekspresi protein dengan ukuran 12-12.5 kDa yang sesuai dengan prediksi ukuran VNAR HB17. Dapat disimpulkan VNAR HB17 anti-HBsAg Chiloscyllium plagiosum dapat diekspresikan secara rekombinan pada periplasma E.coli BL21(DE3)