Perpustakaan Digital ITB

Mitokondria merupakan organel yang memiliki dua fungsi. Pada sel sehat, mitokondria berperan sebagai pabrik energi yang sangat diperlukan bagi kelangsungan hidup sel. Pada beberapa kondisi yang ditimbulkan oleh agen stress, mitokondria mengarahkan sel untuk berada pada fase kematian yang tidak dapat balik. Molekul sitotoksik dapat mempengaruhi kelangsungan hidup sel, tidak hanya memprovokasi terjadinya gangguan fungsi mitokondria, tetapi juga menyebabkan pelepasan protein-protein letal mitokondria ke sitoplasma. Salah satu protein tersebut adalah Apoptosis-Inducing Factor (AIF), yang awalnya diketahui sebagai efektor kematian yang bebas kaspase. Pada sel-sel yang terinduksi untuk mati, melalui permeabilitas membran luar mitokondria, AIF yang semula berada di dalam mitokondria akan bertranslokasi ke sitoplasma, lalu ke inti sel untuk berpartisipasi dalam kondensasi kromatin dan degradasi DNA. Disamping regulasinya dalam kematian sel, AIF memainkan peran vital dalam mitokondria pada sel sehat, yaitu dengan meregulasi aktivitas rantai respirasi. Baru-baru ini diusulkan adanya fungsi tambahan pada AIF (dalam konteks regulasinya pada rantai respirasi), AIF memiliki aktivitas dalam metabolisme senyawa kuinon, salah satunya adalah menadione (2-methyl-1,4-naphtoquinone; vitamin K3), dengan bertindak sebagai NAD(P)H : kuinon reduktase, dengan memfasilitasi reaksi reduksi kuinon menjadi senyawa semikuinon atau hidrokuinon yang bersifat toksik. Reduksi menadion dikaitkan dengan kecepatan siklus redoks yang berkonsekuensi pada terjadinya stress oksidatif di dalam sel. Selain reduksi, menadion bisa melakukan arilasi dengan antioksidan glutation (GSH) dengan membentuk senyawa tiodion yang juga bersifat toksik. Oleh karena itu, memahami metabolisme seluler kuinon merupakan hal penting dalam bidang onkologi karena senyawa kuinon telah berhasil dieksplorasi berkaitan dengan potensi anti kankernya. Selain itu, mempelajari peran kematian AIF mitokondria sangat penting, khususnya berkaitan dengan perkembangan resistensi kanker dan kontribusinya dalam penemuan target terapi baru.Penelitian ini didedikasikan untuk melakukan karakterisasi AIF mitokondria sebagai dampak dari sitotoksisitas salah satu jenis senyawa kuinon, yaitu menadione. Lini sel U2OS yang berasal dari osteosarcoma manusia digunakan sebagai model sel dalam studi ini. Beberapa percobaan yang bersesuaian untuk mempelajari respon sel terhadap menadione telah dilakukan, diantaranya kultur sel mamalia, perlakuan sel dengan obat, dan transfeksi sel dengan siRNA (small interference Ribonucleic Acid). Pendekatan berbasis flow cytometry diterapkan untuk mengamati dan menganalisa perubahan-perubahan yang terjadi pada sel-sel U2OS terhadap induksi menadione. Studi komputasi dilakukan untuk mengevaluasi dan menganalisa interaksi gugus fungsi menadione terhadap residu-residu AIF. Beberapa perangkat lunak digunakan untuk mendukung studi in silico ini diantaranya; penjajaran struktur 3D protein menggunakan program FATCAT dan studi docking menggunakan program AutoDock vina untuk mengevaluasi dan menganalisa peran AIF mitokondria dalam metabolisme menadion.Hasil penelitian menunjukkan bahwa AIF berkontribusi pada kematian sel yang diinduksi oleh menadion, pada kondisi dimana induksi ini tidak menyebabkan hilangnya permeabilitas membran mitokondria atau dengan kata lain AIF melakukan aksi letalnya tetap di dalam mitokondria (tidak dengan menggunakan aktifitas nukleasenya yang menuntutnya untuk keluar dari mitokondria). Tipe kematian sel yang diinduksi oleh menadion adalah apoptosis, dengan jalur kematian bebas kaspase. Pengujian dengan inhibitor kompleks I rantai respirasi (rotenone) mengungkapkan bahwa efek sitoprotektif akibat ketiadaan AIF tidak bergantung pada aktivitas rantai respirasi. Fenomena ini sekaligus mengungkapkan bahwa aksi letal AIF tidak ada kaitannya dengan aksinya sebagai NADH:quinone reduktase. Flow cytometry juga menunjukkan terbentuknya tiodion, yang juga diketahui sebagai peristiwa yang mendahului kematian sel akibat menadion. Teknik siRNA mengungkapkan bahwa tingkat tiodion mengalami penurunan pada sel-sel tanpa AIF. Keterlibatan AIF dalam proses arilasi menadion dikuatkan dengan terjaganya ketinggian tingkat GSH pada sel-sel tanpa AIF. Semua hasil ini mengungkapkan bahwa AIF berperan dalam memfasilitasi toksisitas menadion, lebih spesifiknya dengan meningkatkan arilasi protein sel dan penurunan tingkat GSH. Studi komputasi mengkonfirmasi keterlibatan AIF pada kematian sel, dengan mengungkapkan kestabilan interaksi AIF-menadione yang lebih tinggi 20% dibandingkan dengan NQO1-menadione (enzim mitokondria yang terlibat dalam reduksi dua-elektron senyawa golongan kuinon). Hasil penjajaran struktur AIF dengan enzim transferase GST (glutation-S-transferase) menunjukkan bahwa AIF tidak memiliki residu katalitik transferase. Analisa energi afinitas mengungkapkan bahwa tiodion memiliki afinitas dengan AIF lebih baik dibandingkan prekursornya; menadione atau GSH. Lebih lagi, meskipun jumlah residu pengenal tiodion sampai 45 % lebih tinggi dibandingkan dengan prekursornya, lebih dari setengah struktur tiodion tidak berhimpit dengan FAD, bahkan menjauhi struktur AIF. Sementara itu struktur menadione/GSH posisinya berhimpitan dg FAD dan bahkan terkubur di dalam struktur AIF. Hal ini semakin menguatkan kesimpulan bahwa AIF memfasilitasi proses arilasi menadion dengan melakukan stabilisasi tiodione, bukan dengan berinteraksi dengan menadion atau GSH secara langsung.