Perpustakaan Digital ITB

Tingginya beban tuberkulosis (TB) yang ditanggung Indonesia disebabkan oleh rendahnya cakupan diagnosis akibat keterbatasan akses terhadap fasilitas laboratorium yang memadai. Oleh sebab itu, diperlukan metode diagnosis point-of-care (POC) yang tepat, yaitu lateral flow immunoassay (LFIA) yang menargetkan lipoarabinomannan (LAM), antigen spesifik yang terdapat pada dinding Mycobacterium tuberculosis (Mtb). Kinerja LFIA bergantung pada kualitas antibodi yang digunakan. Produksi antibodi rekombinan menggunakan E. coli menawarkan banyak keuntungan, namun masih menghadapi berbagai tantangan. Penelitian ini ditujukan untuk merekonstruksi dan merancang gen Fab antiLAM pada plasmid pET21b(+) yang sesuai untuk sistem ekspresi periplasma pada E. coli, menganalisis laju ekspresi serta stabilitas dari gen Fab antiLAM, dan mengonfirmasi keberhasilan ekspresi Fab antiLAM pada sistem E. coli Origami B (DE3) sebagai kandidat antibodi rekombinan untuk aplikasi diagnostik tuberkulosis. Studi in silico dimulai dengan merekonstruksi sekuens Fab antiLAM, dilanjutkan dengan anotasi sekuens, alterasi bagian FR secara manual berdasarkan codon usage pada E. coli, dan analisis laju translasi. Struktur sekunder mRNA diprediksi dan dianalisis daerah RBS-nya, sedangkan struktur 3D protein dimodelkan, dievaluasi, dan dilakukan structural refinement. Selain itu, dilakukan prediksi pembentukan ikatan disulfida, analisis interaksi antar-rantai, dan analisis molecular docking. Kemudian, tahapan in vitro dimulai dengan mentransformasi plasmid menggunakan metode kejut panas, dan hasilnya dikonfirmasi melalui PCR koloni. Ekspresi protein Fab antiLAM diinduksi menggunakan 0.5 mM IPTG pada OD600 0.3-0.4 dan hasilnya dikonfirmasi secara SDS-PAGE reducing dan non-reducing. Rekonstruksi gen Fab antiLAM pada sistem E. coli Origami B (DE3) menggunakan vektor ekspresi pET21b(+) menghasilkan plasmid dengan ukuran 1445 bp. RBS yang telah direkonstruksi memiliki nilai minimum free energy (MFE) -10.93 kcal/mol dengan translation initiation rate (TIR) 4,506 untuk RBS light chain (LC) dan MFE -9.96 kcal/mol dengan TIR 3,453 untuk RBS heavy chain (HC). Struktur 3D Fab antiLAM menghasilkan Molprobity score 1.08. Analisis interaksi antar-rantai Fab antiLAM menghasilkan kecenderungan untuk membentuk heterodimer dengan bukti nilai interface area 15.5% untuk LC dan 15.3% untuk HC yang relatif lebih tinggi dibandingkan dengan hasil interaksi homodimer LC dan HC. Prediksi pembentukan ikatan disulfida menghasilkan 2 pasang pada masing-masing rantai Fab dengan jarak sekitar 2.0–2.2 Å. Analisis molecular docking menghasilkan nilai afinitas pengikatan -7.761 kcal/mol untuk epitope Ara4, -6.451 kcal/mol untuk epitope Ara6, dan -6.590 kcal/mol untuk epitope MTX. Konfirmasi transformasi melalui PCR koloni menghasilkan pita amplicon ~1700 bp. Hasil SDS-PAGE reducing menghasilkan pita protein ~26 kDa yang sesuai dengan berat target protein. Namun, pada hasil SDS-PAGE non-reducing belum ditemukan target protein ~53 kDa. Penelitian yang telah dilakukan menunjukkan bahwa monomer rantai Fab antiLAM berhasil diekspresikan. Namun, formasi heterodimer Fab antiLAM utuh belum terdeteksi secara in vitro, sehingga masih diperlukan optimasi produksi in vitro. Hasil in silico menunjukkan adanya afinitas ikatan yang baik terhadap epitope LAM, menjadikan kandidat ini berpotensi untuk dijadikan sebagai komponen platform LFIA apabila optimasi produksi dan pelipatan protein in vitro berhasil dilakukan.