Perpustakaan Digital ITB

Tumbuhan Morus merupakan salah satu genus penting dari famili Moraceae yang menghasilkan metabolit sekunder golongan fenolik seperti flavonoid, stilbenoid, 2-arilbenzofuran, dan adduct Diels-Alder. Senyawa fenolik dari tumbuhan Morus memiliki ciri khas dengan adanya gugus prenil, gugus ini menyebabkan keanekaragaman kerangka molekul pada senyawa prenilfenol. Senyawa prenilfenol secara umum memiliki bioaktivitas yang lebih tinggi jika dibandingkan dengan senyawa fenolik yang tak terprenilasi. Senyawa prenilfenol dapat mengalami reaksi oksidasi pada gugus prenilnya menghasilkan dehidroprenil fenol yang merupakan prekursor penting dalam pembentukan senyawa adduct Diels-Alder. Senyawa adduct Diels-Alder merupakan senyawa fenolik yang khas pada tumbuhan Morus yang terbentuk dari suatu diena dari dehidroprenil fenol dengan suatu dienofil dari α-β karbonil tak jenuh dari suatu calkon. Golongan senyawa ini memiliki bioaktivitas sebagai antioksidan, antibakteri, antiinflamasi, dan antikanker. Teknik kultur jaringan digunakan untuk perbanyakan sampel kultur akar Morus, teknik kultur jaringan merupakan metode bioteknologi yang ramah lingkungan dan dapat menjadi alternatif untuk perbanyakan sampel tumbuhan. Teknik ini memiliki berbagai keunggulan seperti dapat menghasilkan kultur tumbuhan yang bebas dari kontaminasi dari mikroorganisme. Studi terhadap tumbuhan Morus yang dikembangkan secara kultur jaringan menunjukan bahwa senyawa adduct Diels-Alder adalah komponen utama dan memiliki aktivitas sitotoksik terhadap sel murin leukemia P388. Pada penelitian ini dilakukan investigasi terhadap Diels-Alderase yang diduga terlibat dalam biosintesis senyawa adduct Diels-Alder melalui reaksi sikloadisi [4+2], sumber enzim ini didapat dari kultur akar Morus shalun usia 7 minggu. Diels-Alderase diperoleh melalui homogenasi kultur akar M. shalun dengan nitrogen cair dan dihaluskan menggunakan mortal, ekstraksi dengan bufer fosfat pH 6.5 dilanjutkan dengan sonikasi dan sentrifugasi 5000 rpm selama 30 menit pada suhu 4 o C. Supernatan hasil sentrifugasi yang merupakan ekstrak kasar enzim. Diels-Alderase difraksinasi menggunakan garam amonium sulfat dan dilanjutkan dengan dialisis menggunakan 20 mM bufer fosfat pH 6,5. Pemurnian Diels-Alderase dilakukan dengan metode kromatografi penukar ion menggunakan resin DEAE anion. Pemurnian Diels-Alderase meliputi tahapan persiapan dan penyetimbangan resin, pengikatan protein dengan resin, dan tahapan elusi menggunakan berbagai konsentrasi garam NaCl. Kadar protein ditentukan dengan menggunakan metode Bradford dan penentuan massa molekul protein dengan metode elektroforesis (SDS PAGE). Aktivitas enzim diuji dengan menginkubasi fraksi enzim dengan 1 mM moracalkon A sebagai substrat pada suhu 37 o C selama 2 jam dan produk kuwanon J dideteksi dengan HPLC. Moracalkon A merupakan metabolit sekunder dari golongan calkon yang diisolasi dari tumbuhan Morus. Senyawa ini memiliki gugus prenil yang berpotensi menghasilkan dehidroprenil (diena) melalui reaksi oksidasi dan gugus α,β-karbonil (dienofil). Dehidropenil-moracalkon A dan moracalkon A yang diharapkan dengan Diels-Alderase mengalami reaksi sikloadisi [4+2] intermolekul menghasilkan kuwanon J, suatu adduct Diels-Alder yang memiliki aktivitas sitotoksik terhadap sel murin leukemia P388 (IC50 5,9 μg/ml) dan sebagai anti-HIF 1 (hypocia inducible factor). Diels-Alderase yang diisolasi dari kultur akar Morus shalun yang baru pertama kali dilaporkan. Diels-Alderase sejauh ini dilaporkan diperoleh dari mikroorganisme yang mengkatalisis reaksi sikloadisi [4+2] intramolekul, sedangkan Diels-Alderase hasil isolasi mengkatalisis reaksi sikloadisi [4+2] intermolekul antara suatu dehidroprenil-moracalkon A sebagai diena dengan gugus α,β-karbonil tak jenuh dari moracalkon A sebagai dienofil menghasilkan senyawa kuwanon J. Diels-Alderase hasil pemurnian memiliki massa molekul sekitar 20 kDa dan 40 kDa, dengan aktivitas spesifik sebesar 6139,05 Unit/mg dan peningkatan kemurnian enzim diperoleh sebesar 32 kali dibandingkan dengan fraksi amonium sulfat. Analisis hasil reaksi enzimatis dengan LCMS menunjukan puncak di kromatogram yang memiliki waktu retensi sama dengan kuwanon J standar dengan massa molekul m/z 679,42 [M+H]+ yang mengkonfirmasi aktivitas Diels-Alderase dari kultur akar M. shalun.