Perpustakaan Digital ITB

Tuberkulosis (TB) merupakan penyakit yang disebabkan oleh Mycobacterium tuberculosis dan merupakan penyakit penyebab mortalitas tertinggi kedua akibat agen infeksi tunggal setelah Covid-19. Hingga saat ini, kebanyakan dari metode diagnostik yang tersedia hanya mampu mendeteksi TB aktif. Sementara, metode diagnostik untuk mendeteksi TB laten masih memiliki kendala seperti hasil false positive dan sulit diaksesnya alat diagnostik pada daerah perifer. Metode diagnostik berbasis antibodi bispesifik berpotensi untuk mendeteksi TB aktif dan laten secara bersamaan. PstS1 merupakan antigen yang telah terbukti dapat dijadikan target untuk mendeteksi TB laten. Namun, penelitian dan pengembangan dari antibodi yang menargetkan antigen PstS1 belum pernah dilakukan. Penelitian ini bertujuan untuk mengoptimasi ekspresi half-antibody anti-PstS1 pada E. coli Origami B (DE3) dengan variasi temperatur dan waktu induksi sebagai pengembangan antibodi bispesifik. Gen sintetik pengkode rantai ringan dan berat dari anti-PstS1 ditransformasikan ke E. coli Origami B (DE3) dan selanjutnya dikonfirmasi dengan PCR koloni. Plasmid dan RNA total diisolasi dari koloni bakteri transforman yang ditumbuhkan dalam medium cair Luria Bertani. Isolat plasmid kemudian disekuensing dan dianalisis urutan DNA-nya. RNA total dari kultur bakteri rekombinan diisolasi dan selanjutnya dilakukan RT-PCR untuk mengonfirmasi keberhasilan transkripsi. Evaluasi struktur sekunder mRNA dilakukan dengan RNAfold dan UNAFold menggunakan pendekatan Minimum Free Energy dan Centroid. Ekspresi anti-PstS1 dilakukan dengan variasi temperatur induksi (suhu 37?, suhu ruang, dan suhu 16?) dan variasi waktu induksi (pada fase early, mid, dan late logarithmic) dengan penambahan IPTG. Hasil ekspresi dari fraksi solubel dan insolubel dipurifikasi dengan menggunakan kolom Ni-NTA. Berdasarkan hasil yang diperoleh, diketahui bahwa plasmid dan RNA total telah berhasil diisolasi. Hasil sekuensing menunjukkan adanya substitusi yang bersifat missense, serta insersi pada satu dari dua hasil sekuensing yang membentuk kodon stop prematur pada rantai berat dan menghasilkan protein berukuran 37,45 kDa. Hasil isolasi RNA dan RT-PCR menunjukkan transkripsi dari rantai ringan dan berat berhasil dilakukan. Evaluasi struktur sekunder mRNA menunjukkan pembentukan struktur sekunder mRNA pada bagian Ribosome Binding Site (RBS) rantai ringan yang lebih favorable dibandingkan pada RBS rantai berat. Pada visualisasi hasil SDS-PAGE dari hasil ekspresi protein, tidak teramati pita berukuran sekitar 23 kDa (rantai ringan) dan 55 kDa (rantai berat). Namun, teramati pita berukuran sekitar 37 kDa pada perlakuan temperatur 37?, suhu ruang, dan 16? dalam fase solubel pada fase pertumbuhan early dan mid logarithmic, dan dalam fase insolubel pada fase pertumbuhan early, mid, dan late logarithmic. Kesimpulan yang diperoleh dari penelitian ini adalah rantai berat half-antibody anti-PstS1 telah berhasil diekspresikan dalam bentuk yang terpotong, namun rantai ringan dari half-antibody anti-PstS1 tidak terekspresikan. Oleh karena itu, dibutuhkan penelitian lebih lanjut untuk menghasilkan ekspresi protein rekombinan yang lebih baik.