Resistensi antimikroba merupakan salah satu ancaman global yang serius. Berbagai percobaan dilakukan untuk mencari kandidat obat baru untuk menyelesaikan masalah resistensi antimikroba salah satunya dengan mencari senyawa metabolit sekunder dari mikroba asal laut. Aspergillus flocculosus (kode FSB-27) merupakan jamur koleksi Laboratorium Mikrobiologi Sekolah Farmasi ITB asal Tulamben, Bali yang diisolasi dari terumbu karang. Aspergillus flocculosus menunjukkan aktivitas antimikroba terhadap Candida albicans, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, dan Mycobacterium smegmatis. Penelitian ini dilakukan untuk mendapatkan fraksi metabolit sekunder dari Aspergillus flocculosus yang memiliki aktivitas antimikroba. Penelitian ini meliputi proses peremajaan, identifikasi, fermentasi, ekstraksi metabolit sekunder, fraksinasi metabolit sekunder, subfraksinasi metabolit sekunder, dan uji aktivitas terhadap mikroba. Uji aktivitas menggunakan difusi cakram digunakan untuk skrining aktivitas antibakteri dan antijamur dan mikrodilusi digunakan untuk menentukan konsentrasi hambat minimum (KHM). Sedangkan, pada antimikobakteria digunakan metode uji MTT untuk skrining aktivitas serta penentuan nilai KHM. Nilai konsentrasi bakterisidal/fungisidal minimum (KBM/KFM) dilakukan dengan drop tes. Hasil penelitian menunjukkan ekstrak media memiliki aktivitas terhadap seluruh mikroba uji, sedangkan ekstrak miselium memberikan aktivitas kepada Staphylococcus aureus. Fraksi metanol dan heksana memberikan aktivitas terhadap semua mikroba uji. Hasil subfraksinasi dari fraksi metanol menunjukkan subfraksi D mempunyai aktivitas yang moderat terhadap Escherichia coli, Staphylococcus aureus, dan Mycobacterium smegmatis dengan nilai KHM berturut-turut sebesar 500, 250, dan 500 ?g/mL. Subfraksi D memberikan aktivitas fungisida yang moderat terhadap Candida albicans dengan nilai KFM 250 ?g/mL. Subfraksi C dan E memberikan aktivitas yang lemah terhadap Candida albicans dengan nilai KHM 1000 ?g/mL. Secara umum hasil fraksinasi ekstrak etil asetat kultur Aspergillus flocculosus berpotensi sebagai sumber antimikroba.