????-Amilase adalah endoenzim yang mengkatalisis reaksi pemutusan ikatan ????-1,4
glikosidik pada polisakarida. ????-Amilase telah banyak digunakan pada berbagai
macam industri, seperti industri pengolahan pati, tekstil, roti, dan farmasi. Kondisi
penggunaan enzim di dunia industri seringkali ekstrim. Oleh karena itu, sangatlah
penting untuk meningkatkan kestabilan pH dan temperatur dari enzim.
Peningkatan kestabilan enzim dapat dilakukan dengan menambahkan ikatan
disulfida. Pada penelitian sebelumnya, mutan ????-amylase Saccharomycopsis
fibuligera yang memiliki sebuah ikatan disulfida baru pada domain A-C
(S316C/S417C) telah berhasil dikonstruksi. Telah diketahui bahwa domain B dari
????-amilase menentukan sejumlah fungsi dan kestabilan dari enzim tersebut.
Penambahan sebuah ikatan disulfida baru pada domain ini diprediksi dapat
meningatkan kestabilan dari enzim. Tujuan dari penelitian ini adalah
mengkonstruksi dan mengkarakterisasi mutan alp1 yang memiliki sebuah ikatan
disulfida baru pada domain B. Mutasi terarah dilakukan untuk mendapatkan
mutan alp1E173C/L180C. Karakterisasi ALP1, alp1S316C/S417C, dan
alp1E173C/L180C yang diproduksi di Pichia pastoris menunjukkan bahwa enzim
ini memiliki pH optimum 5,5 dan temperatur optimum 50°C. alp1E173C/L180C
mampu mempertahankan aktivitasnya lebih tinggi dibandingkan ALP1 dan
alp1S316C/S417C pada pH rendah dan temperatur tinggi. Berat molekul dari
ALP1, alp1S316C/S417C, dan alp1E173C/L180C adalah sekitar 59 kDa. Analisis
produk akhir hidrolisis dengan kromatografi lapis tipis menunjukkan bahwa
produk utama dari ALP1, alp1S316C/S417C, dan alp1E173C/L180C adalah
maltosa, maltotriosa, dan sedikit glukosa. Tm dari enzim adalah 58°C untuk ALP1
dan 56°C untuk alp1S316C/S417C dan alp1E173C/L180C. Penambahan Zn2+
memberikan dampak negatif pada kestabilan ALP1 dan alp1S316C/S417C, tetapi
tidak memberikan pengaruh pada kestabilan alp1E173C/L180C.