Daun tebu merupakan sumber biomassa lignoselulosa yang belum dimanfaatkan secara optimal di Indonesia, karena seringkali hanya ditinggal di lahan dan dibakar setelah panen tebu. Terdapat berbagai potensi yang dimiliki oleh lignoselulosa, salah satunya sebagai substrat untuk memproduksi xylitol. Bahan baku xylitol berasal dari hemiselulosa, namun senyawa ini terikat di dalam lignoselulosa, sehingga harus dilakukan suatu perlakuan awal seperti prahidrolisis untuk melepas dan melarutkan hemiselulosa. Asam encer diketahui sangat baik digunakan sebagai agen prahidrolisis dengan suhu tinggi dalam industri, adapun asam organik encer dapat menghasilkan sedikit atau hampir tidak ada senyawa toksik (furfural dan 5-hidroksimetilfurfural (HMF)). Oleh karena itu, penelitian ini bertujuan untuk menginvestigasi pengaruh prahidrolisis daun tebu dengan menggunakan asam oksalat dan ekstrak kasar medium jamur Aspergillus niger. Tiga variasi suhu (130, 160, 190 oC) digunakan untuk menentukan perlakuan terbaik dibandingkan kontrol (H2SO4, 3% (w/w), 130 oC). Hasil penelitian ini menunjukkan jamur Aspergillus niger dapat menghasilkan asam oksalat hingga mencapai konsentrasi 1,84 g/100 mL. Ekstrak kasar medium jamur tersebut dapat meningkatkan aksesibilitas selulosa karena terhidrolisisnya hemiselulosa dan sebagian lignin. Hemiselulosa yang terhidrolisis paling baik pada suhu 190 oC dengan massa hemiselulosa akhir 1,27 ± 0,0225 g. Hasil ini lebih rendah dibandingkan prahidrolisis menggunakan asam oksalat pada suhu 160 oC (1,39 ± 0,0582 g), namun tetap lebih tinggi dibandingkan kontrol (0,31 ± 0,0648 g). Hidrolisat hasil prahidrolisis menggunakan ekstrak kasar medium jamur memiliki tingkat toksisitas lebih rendah karena tidak menghasilkan senyawa toksik (furfural dan HMF), sehingga relatif lebih aman untuk digunakan dalam proses fermentasi lanjutan.