Perpustakaan Digital ITB

Metode transformasi genetik pada tanaman dengan perantaraan Agrobacterium tumefaciens merupakan metode yang umumnya digunakan untuk mengintroduksi gen asing ke dalam genom tanaman. Keberhasilan transformasi genetik tanaman ditandai dengan integrasi, ekspresi dan stabilitas gen yang disisipkan dalam tanaman/bagian tanaman beserta keturunannya. Tujuan dari penelitian ini adalah mentransformasi jaringan Andrographis paniculata dengan perantara Ag. tumefaciens LBA4404 dan menganalisis stabilitas ekspresi transgen pada kalus transforman pada beberapa periode subkultur. Eksplan daun A. paniculata diinfeksi dengan Ag. tumefaciens LBA4404 yang mengandung vektor ganda pCAMBIA1304 yang membawa gen pelapor gusA dan gen penanda hpt (hygromycin phosphotransferase). Infeksi dilakukan dengan perendaman eksplan dalam suspensi Ag. tumefaciens selama 60 menit dengan penambahan 100 ?M asetosiringon, diikuti dengan ko-kultivasi selama 3 hari pada medium Murashige dan Skoog (MS) dengan penambahan 0,5 ?M 2,4-D dan 0,1 ?M BAP. Seleksi jaringan yang ditransformasi dilakukan dengan menumbuhkan potongan daun yang diinfeksi pada medium MS yang mengandung 0,5 ?M 2,4-D dan 0,1 ?M BAP dengan penambahan 20 mg/L higromisin sebagai agen penyeleksi dan 400 mg/L sefotaksim sebagai antibiotik untuk mengeliminasi Ag. tumefaciens. Evaluasi transformasi dilakukan berdasarkan uji histokimia GUS dan ketahanan kalus transforman pada medium higromisin. Konfirmasi integrasi T-DNA ke dalam genom A. paniculata dilakukan dengan teknik polymerase chain reaction (PCR) dengan menggunakan primer spesifik gen gusA yang mengamplifikasi fragmen internal gen gusA dengan panjang 976 pb diikuti dengan visualisasi dengan elektroforesis. Hasil uji histokimia GUS pada potongan daun setelah tiga hari kokultivasi menunjukkan ekspresi transien GUS mencapai 18,83%. Sebanyak 64,44% jaringan A. paniculata yang telah berhasil ditransformasi menunjukkan regenerasi sel dengan menghasilkan kultur kalus transforman pada medium yang mengandung 20 mg/L higromisin. Kalus transforman putatif memperlihatkan pertumbuhan pada medium yang mengandung 20 mg/L higromisin selama lima periode subkultur. Analisis PCR yang diikuti dengan visualisasi pada elektroforesis agarosa menunjukkan munculnya larik DNA 976 pb pada line kalus transforman putatif hasil seleksi subkultur 1-5 dan pada kontrol pCAMBIA1304. Berdasarkan hasil tersebut disimpulkan bahwa gen gusA dan hpt dari vektor ganda pCAMBIA1304 telah berhasil disisipkan ke dalam potongan jaringan A. paniculata melalui perantara Ag. tumefaciens LBA4404 dan transgen tersebut berhasil stabil terintegrasi ke dalam genom A. paniculata sampai subkultur ke-5.