Article Details

PENGEMBANGAN TES DIAGNOSTIK DENGUE BERBASIS TAQMAN® REAL-TIME PCR UNTUK DETEKSI DINI DENGUE DI INDONESIA

Oleh   Denti Rizki Kinanti [21121042]
Kontributor / Dosen Pembimbing : Azzania Fibriani, S.Si., M.Si., Ph.D.;
Jenis Koleksi : S2 - Tesis
Penerbit : SITH - Bioteknologi
Fakultas : Sekolah Ilmu dan Teknologi Hayati (SITH)
Subjek :
Kata Kunci : dengue, DENV, rRT-PCR, kurva standar, TaqMan probe
Sumber :
Staf Input/Edit : Irwan Sofiyan  
File : 1 file
Tanggal Input : 22 Jun 2022

Demam berdarah (DB) atau dengue merupakan penyakit yang disebabkan oleh virus dengue (DENV) yang dibawa oleh nyamuk Aedes aegypti dan Aedes albopictus. Dengue bersifat endemik di Indonesia di mana wabah dengue terjadi secara rutin dan tingkat insidensinya cenderung meningkat setiap tahunnya. Deteksi dini secara akurat dan cepat yang dapat dicapai dengan metode real-time PCR dapat menjadi kunci penting penanganan wabah dengue. Pada penelitian sebelumnya, telah berhasil dikembangkan tes diagnostik dengue berbasis SYBR Green rRT-PCR berdasarkan sekuens DENV-1, -2, -3, dan -4 Indonesia. Namun, penggunaan SYBR Green sebagai reporter flouresensi umumnya memiliki keterbatasan yakni adanya potensi false-positive karena amplifikasi nonspesifik dan dimer primer. Untuk mengatasi masalah tersebut, dapat dirancang tes real-time PCR berbasis TaqMan probe sebagai fluorofor. Maka, penelitian ini dilakukan dengan tujuan merancang dan mengkarakterisasi tes diagnostik dengue berbasis TaqMan probe qPCR. Pada penelitian ini, dilakukan perancangan daerah target amplifikasi dengan metode multiple sequence alignment 58 sekuens DENV endemik Indonesia. Perancangan primer dan probe dilakukan dengan BioEdit. Pengujian spesifisitas primer dan probe dilakukan dengan BLAST dan uji rRT-PCR dengan RNA virus ZIKA dan Chikungunya. Kontrol positif dirancang dengan mengkonstruksi target amplifikasi pada plasmid pUC57. Plasmid yang telah dirancang kemudian diperbanyak pada E. coli DH5? dan dikonfirmasi melalui sekuensing. Plasmid kontrol positif yang terkonfirmasi kemudian dikuantifikasi untuk optimasi suhu annealing dan konsentrasi primer-probe serta pembuatan kurva standar rRT-PCR. Penentuan suhu annealing optimum primer dilakukan dengan thermal gradient PCR. Penentuan konsentrasi optimum primer-probe dilakukan dengan rRT-PCR menggunakan 3 variasi konsentrasi untuk masing-masing set primer dan probe sebanyak 3 replikasi uji. Kemudian, karakterisasi rancangan tes diagnostik dilakukan untuk menentukan linearitas kurva standar rRT-PCR, limit kuantifikasi (LOQ), dan limit deteksi (LOD95%) menggunakan SensiFast™ Probe Lo-Rox (Bioline). Pengujian linearitas kurva standar dilakukan menggunakan kontrol positif dengan rentang konsentrasi 5×103 - 2×106 kopi/mL sebanyak 3 replikasi uji. Penentuan LOQ dilakukan dengan menentukan konsentrasi terendah pada kurva standar yang masih menunjukkan linearitas yang baik (R2 ? 0,98). Penentuan LOD95% dilakukan dengan analisis Probit pada pengujian dengan kontrol positif pada rentang konsentrasi 101 – 104 kopi/mL sebanyak 10 kali replikasi uji. Validasi tes diagnostik yang telah dirancang dilakukan menggunakan 74 spesimen klinis pasien suspek dengue yang teruji melalui tes diagnostik cepat berbasis IgG/IgM dan antigen NS1 dengue serta tes diagnostik SYBR Green rRT-PCR Dengue. Hasil penelitian menunjukkan daerah 3’ UTR genom DENV sebagai kandidat probe dan primer. Probe dan primer set B2 terpilih dan teruji spesifik untuk DENV. Plasmid kontrol positif tes diagnostik berhasil diperbanyak dalam E. coli DH5? dan terkonfirmasi melalui analisis sekuensing. Suhu annealing optimum primer terpilih adalah 56oC dengan konsentrasi optimum primer forward, primer reverse, dan probe secara berturut-turut yaitu 300 nM, 300 nM, dan 200 nM. Tes diagnostik yang dirancang memiliki linearitas kurva standar yang baik dengan slope = -3,3724 dan R2 = 0,9885. Nilai LOQ dan LOD dari tes diagnostik yang dikembangkan yaitu 5.000 kopi/mL dan 482 kopi/mL. Tes diagnostik yang telah dirancang mendeteksi 21 hasil positif dari 74 spesimen klinis suspek dengue. Dengan rancangan tes diagnostik TaqMan rRT-PCR Dengue sebagai referensi, uji NS1, IgM, IgG, dan SYBR Green rRT-PCR Dengue menunjukkan sensitivitas 42,86%, 14,29%, 28,57%, dan 80,95% dengan spesifisitas 100%, 90,57%, 69,81%, dan 100% secara berturut-turut. Berdasarkan hasil penelitian ini, dapat disimpulkan bahwa tes diagnostik dengue yang telah dirancang dan dikarakterisasi berhasil memenuhi parameter ideal dari tes diagnostik dan dapat digunakan sebagai kandidat tes diagnostik dengue di Indonesia.