Perpustakaan Digital ITB

?-Amilase (EC 3.2.1.1) adalah enzim endo-akting yang mengkatalisis hidrolisis ikatan ?-1,4-glikosidik dalam pati, menghasilkan maltodekstrin dan gula sederhana. BaqA, suatu ?-amilase dari Bacillus aquimaris MKSC6.2, yang diisolasi dari bakteri laut yang berasosiasi dengan karang lunak di Merak Kecil, Indonesia, merupakan anggota penting dari enzim glikosida hidrolase famili 13 (GH13), yang banyak digunakan dalam aplikasi industri termasuk hidrolisis pati, produksi biofuel, dan pengolahan makanan. Efisiensi enzimatik, spesifisitas substrat, dan stabilitas termal ?-amilase sangat penting bagi penerapannya di industri. BaqA mengandung dua fitur struktural yang diprediksi sangat mempengaruhi kinerja enzim: residu pengikat Ca2+ yang terletak di ?5 domain B dan wilayah urutan terkonservasi CSR-V yang diposisikan pada loop 3. Penelitian ini bertujuan untuk menjelaskan peran fungsional residu ini dalam BaqA terpotong (BaqA?C) melalui pendekatan biokimia dan komputasi terintegrasi. Mutagenesis terarah situs (SDM) digunakan untuk memperkenalkan substitusi asam amino yang ditargetkan pada Q174 dan N185, yang diprediksi memengaruhi pengikatan substrat, pengikatan kalsium, efisiensi katalitik, termostabilitas, dan pembentukan produk. Pemilihan situs mutasi dipandu oleh pemodelan struktural, penyelarasan sekuens dengan ?-amilase yang terkait erat, dan pengetahuan sebelumnya tentang motif katalitik dan pengikatan yang dilestarikan. Profil stabilitas termal dan pH juga ditentukan untuk menyelidiki ketahanan enzim dalam kondisi yang relevan secara industri. Kinetika enzim dinilai menggunakan pati larut sebagai substrat, dan parameter termasuk konstanta Michaelis-Menten (Km), kecepatan maksimum (Vmax), dan efisiensi katalitik (kcat/Km) ditentukan untuk mengevaluasi dampak mutasi pada kinerja katalitik. Secara paralel, analisis struktural in silico, termasuk simulasi docking molekuler dan dinamika molekuler (MD), dilakukan untuk menjelaskan dasar mekanistik dari perubahan fungsional yang diamati. BaqA?CQ174E dan BaqA?CN185D diekspresikan secara heterolog dalam E. coli ArcticExpress (DE3), dengan berat molekul perkiraan ~58 kDa sebagaimana ditentukan dengan analisis SDS PAGE dan dimurnikan dengan kromatografi NiNTA. Aktivitas spesifik ditentukan untuk BaqA?C, BaqA?CQ174E, dan BaqA?CN185D dengan nilai masing-masing 5,8 ± 0,4 U/mg, 6,6 ± 0,8 U/mg, dan 7,6 ± 0,2 U/mg, yang menunjukkan bahwa BaqA?CQ174E dan BaqA?CN185D menunjukkan peningkatan efisiensi katalitik. Menariknya, derajat hidrolisis (DH) dihitung sebesar 1,41% untuk BaqA?C, 2,18% untuk BaqA?CN185D, dan 1,52% untuk BaqA?CQ174E. BaqA?C menunjukkan aktivitas hidrolisis optimal terhadap pati terlarut 2% pada suhu 50 °C dan pH 6,5. Menariknya, baik BaqA?CQ174E maupun BaqA?CN185D menunjukkan pH optimal sebesar 5,5. Secara mengejutkan, mutan BaqA?CQ174E menunjukkan peningkatan waktu paruh dua setengah kali lipat dibandingkan BaqA?C dan peningkatan aktivitas relatif sebesar 185% ketika diberi perlakuan [Ca2+] 10 mM. Kedua varian menunjukkan perubahan signifikan pada sifat enzimatik relatif terhadap BaqA?C, tercermin dalam peningkatan nilai kcat dan penurunan Km, yang menunjukkan peningkatan afinitas dan pergantian substrat. Lebih lanjut, HPLC digunakan untuk mengevaluasi produk hidrolisis pati dari ekstrak protein kasar E. coli ArcticExpress (DE3) yang mengekspresikan BaqA?C, BaqA?CN185D, dan BaqA?CQ174E. Galur kontrol menghasilkan ?-amilase pencair alami, sementara kedua enzim rekombinan menunjukkan aktivitas sakarifikasi. Khususnya, setelah 16 jam inkubasi, BaqA?CN185D menghasilkan glukosa dalam jumlah yang signifikan, sementara BaqA?CQ174E menghasilkan maltosa sekitar 3 kali lipat lebih banyak. Simulasi MD selanjutnya mengonfirmasi penurunan fleksibilitas di wilayah-wilayah penting untuk katalisis pada BaqA?CQ174E dan BaqA?CN185D, yang berkorelasi dengan peningkatan ketahanan termal yang teramati. Studi ini menyediakan kerangka kerja komprehensif untuk memahami hubungan struktur-fungsi dalam ?-amilase terpotong dan menunjukkan potensi mutagenesis rasional untuk mengoptimalkan kinerja enzim bagi aplikasi industri. Pendekatan eksperimental dan komputasional gabungan memungkinkan evaluasi dampak mutasi yang presisi pada tingkat fungsional dan struktural, memberikan wawasan tentang kontribusi spesifik residu terhadap dinamika dan katalisis enzim. Temuan ini tidak hanya menyoroti fleksibilitas BaqA?C sebagai kandidat untuk eksploitasi bioteknologi, tetapi juga membangun fondasi bagi upaya rekayasa protein lebih lanjut yang bertujuan menghasilkan amilase yang tangguh dan berkinerja tinggi yang dirancang khusus untuk proses industri tertentu. Penelitian selanjutnya akan berfokus pada perluasan strategi ini ke varian tambahan, mengeksplorasi efek sinergis dari beberapa mutasi, dan memvalidasi kinerja enzim dalam kondisi operasional skala besar.