Perpustakaan Digital ITB

Teknologi Polymerase Chain Reaction (PCR) merupakan metode utama dalam deteksi molekuler karena sensitivitas dan spesifisitasnya yang tinggi. Namun, ketergantungan master mix PCR konvensional pada penyimpanan rantai dingin (cold chain) suhu -20°C menjadi kendala dalam distribusi reagen ke fasilitas kesehatan dengan infrastruktur terbatas di daerah pelosok negara tropis seperti Indonesia. Liofilisasi (freeze-drying) merupakan salah satu solusi alternatif, namun proses ini tidak dapat diaplikasikan pada produk komersial yang umumnya mengandung gliserol. Pfu polymerase adalah enzim yang memiliki stabilitas termal dan fidelitas yang jauh lebih tinggi. Penelitian ini bertujuan untuk memproduksi Pfu polymerase secara in-house dan memformulasikan liofilisat master mix PCR bebas gliserol dengan lioprotektan yang stabil pada suhu tropis untuk deteksi gen rpoB Mycobacterium tuberculosis. Tahapan penelitian diawali dengan proses transformasi plasmid rekombinan yang mengandung gen sintetik rpoB dan dilanjutkan dengan isolasi plasmid sebagai template DNA kontrol positif PCR. Selanjutnya, pelet sel enzim Pfu polymerase disonifikasi dengan lysis buffer serta dipurifikasi melalui empat variasi kombinasi DNase-free dan heat treatment, lalu diuji aktivitas amplifikasi dengan target rpoB. Kemudian, enzim pfu hasil purifikasi dioptimasi menjadi master mix PCR bebas gliserol yang dikombinasikan dengan lioprotektan Trehalose 4% dan BSA 0.05% dan diliofilisasi. Selanjutnya, Uji stabilitas reagen dilakukan selama 28 hari dengan menyimpan liofilisat pada variasi suhu -20°C, 4°C, 28°C, dan 37°C serta dievaluasi melalui PCR gel-based dan densitometri gel agarosa untuk melihat efisiensi amplifikasinya. Analisis kinetika menggunakan model regresi linier Arrhenius digunakan untuk memprediksi umur simpan liofilisat. Hasil penelitian menunjukkan kombinasi penggunaan DNase I dan heat treatment merupakan metode purifikasi paling optimal yang dikonfirmasi oleh munculnya pita protein spesifik ~90 kDa pada SDS-PAGE dan aktivitas amplifikasi yang baik pada konsentrasi 9,25 ng. Pada uji stabilitas tanpa lioprotektan, aktivitas amplifikasi liofilisat hilang sepenuhnya (0%) sejak hari ke-7. Sebaliknya, penambahan lioprotektan terbukti efektif secara signifikan (p<0,05) melindungi enzim selama proses liofilisasi dan penyimpanan. Pada suhu -20°C, iv intensitas amplifikasi tetap stabil dari 97,69% ± 8,85% di minggu pertama hingga 81,43% ± 22,45% pada hari ke-28. Pada suhu 4°C, intensitas menurun dari 97,53% ± 1,14% menjadi 37,04% ± 2,22% di akhir pengujian. Selanjutnya, pada suhu ruang 28°C, intensitas rata-rata terdegradasi lebih cepat dari 84,13% ± 8,07% di minggu pertama hingga tersisa 29,71% ± 15,75% pada minggu keempat. Sementara itu, paparan suhu ekstrem 37°C memicu degradasi paling tajam dengan rata-rata intensitas turun dari 60,45% ± 2,02% menjadi hanya 6,73% ± 7,28% pada akhir masa uji. Analisis kinetika menggunakan model regresi linier Arrhenius memprediksi umur simpan liofilisat mencapai 121 hari pada suhu -20°C, 86 hari pada 4°C, 18 hari pada 28°C, dan 13 hari pada 37°C. Umur simpan selama 18 hari pada suhu ruang menunjukkan bahwa reagen ini cukup dapat bertahan untuk logistik pengiriman ke daerah terpencil. Penelitian ini membuktikan bahwa formulasi liofilisat ini dapat meningkatkan aksesibilitas deteksi TB di fasilitas kesehatan primer. Meskipun kedepannya perlu dilakukan optimasi jenis lioprotektan lainnya untuk memperpanjang masa simpan serta optimasi ke metode real-time PCR untuk menciptakan kit diagnostik yang lebih efisien.