Perpustakaan Digital ITB

Infeksi hepatitis B kronis (HBK) masih menjadi masalah kesehatan global meskipun vaksin profilaksis telah tersedia. Masalah utama pada penderita HBK adalah keberadaan covalently closed circular DNA (cccDNA) virus hepatitis B (VHB) secara persisten dan kelelahan pada sel T. Vaksin terapeutik berbasis protein inti (HBc) dan protein X (HBx) VHB berpotensi mengatasi masalah tersebut, namun dalam pengembangannya belum mempertimbangkan keragaman genotipe VHB dan masih menggunakan platform konvensional. Penelitian ini bertujuan mengembangkan kandidat vaksin mRNA terapeutik multiepitop berbasis HBc dan HBx lintas genotipe VHB dengan adjuvan flagelin (FliC) melalui pendekatan integratif reverse vaccinology (RV) dan imunoinformatika. Penelitian diawali dengan desain komputasional menggunakan pendekatan RV dan imunoinformatika. Epitop Cytotoxic T Lymphocyte (CTL), Helper T Lymphocyte (HTL), dan sel B diprediksi serta diseleksi berdasarkan antigenisitas, imunogenisitas dan profil keamanan. Analisis kemudian dilanjutkan dengan evaluasi cakupan populasi, perancangan konstruksi multiepitop terintegrasi adjuvan, serta validasi in silico melalui pemodelan struktur tiga dimensi, molecular docking, dinamika molekuler, dan simulasi respon imun. Selanjutnya, dilakukan rekayasa molekuler dan sintesis mRNA yang mencakup desain mRNA fungsional, optimasi kodon, analisis struktur sekunder, serta integrasi elemen regulator translasi. Konstruksi dikloning ke dalam plasmid pcDNA3.1(+) sebagai cetakan transkripsi in vitro dengan promotor T7, dimodifikasi menggunakan 5? cap Anti-Reverse Cap Analog (ARCA) dan ekor poli(A), kemudian dimurnikan dan dikarakterisasi. Kandidat vaksin yang dihasilkan kemudian dievaluasi secara in vitro menggunakan sel Human Embryonic Kidney 293T (HEK293T) melalui pembentukan kompleks lipid–mRNA, transfeksi, serta analisis ekspresi secara kualitatif dan kuantitatif. Pada penelitian ini berhasil dikumpulkan 13.610 sekuens HBc dan 12.333 sekuens HBx dari sepuluh genotipe VHB global (1963–2023). Pada HBc teridentifikasi empat epitop CTL, tiga HTL, dan tiga sel B, sedangkan pada HBx diperoleh tiga epitop CTL, dua HTL, dan dua sel B yang memenuhi kriteria inklusi. Epitop terpilih diprediksi memiliki cakupan populasi global sebesar 99,43%. Beberapa epitop juga dikenali oleh alel HLA-DP yang berasosiasi dengan kerentanan terhadap HBK. Penelusuran pada Immune Epitope Database menunjukkan sembilan dari 14 epitop merupakan temuan baru, menegaskan kontribusi orisinal penelitian ini. Kandidat vaksin K16 yang mengombinasikan adjuvan FliC dan Pan HLA DR-Binding Epitope terpilih sebagai kandidat terbaik. Pemodelan molekuler menunjukkan potensi K16 berinteraksi dengan kompleks TLR4-MD2, B Cell Receptor (BCR), dan T Cell Receptor (TCR). Simulasi dinamika molekuler selama 100 ns menunjukkan kestabilan kompleks dengan energi bebas ?40,3 kcal/mol (TLR4–MD2), ?5,6 kcal/mol (BCR), dan ?17 kcal/mol (TCR). Simulasi respon imun in silico memprediksi bahwa K16 berpotensi meningkatkan proliferasi sel T sitotoksik, sel T helper, dan sel B, serta produksi IFN-?, IL-2, dan IgG1. Optimasi kodon pada sekuens pengode K16 menghasilkan nilai Codon Adaptation Index sebesar 0,94 yang menunjukkan bahwa distribusi kodon sekuens K16 telah selaras dengan preferensi kodon sel mamalia. Prediksi struktur sekunder mRNA menunjukkan minimum free energy sebesar ?742,40 kcal/mol, dengan stabilitas memadai pada wilayah 5’UTR–Kozak (?38,10 kcal/mol) dan sinyal poli(A) bGH (?90,30 kcal/mol), sehingga mendukung translasi. Transkripsi in vitro menghasilkan mRNA sepanjang 2.590 basa (yield 36 ± 0,22 ?g, kemurnian 2,21, dan integritas baik), yang berhasil dimodifikasi dengan 5’cap ARCA dan ekor poli(A). mRNA dapat membentuk kompleks dengan Lipofectamine MessengerMAX (efisiensi 75,38%) serta membentuk partikel sferis berukuran ±200 nm. Transfeksi mRNA ke dalam sel HEK293T menghasilkan ekspresi protein yang terdeteksi melalui fluoresensi Green Fluorescent Protein (GFP) yang terfusi pada ujung C-terminal K16. Analisis kuantitatif menunjukkan bahwa intensitas fluoresensi K16-GFP (414,50 ± 10,53 RFU) lebih tinggi signifikan (p< 0,0001) dibandingkan dengan kontrol negatif (107,48 ± 6,08 RFU). Nilai tersebut mengindikasikan bahwa mRNA pengode K16-GFP berhasil ditranslasikan dan menghasilkan protein yang mengandung domain GFP fungsional. Residual DNA plasmid sebesar 0,0023 ± 0,00001 ng/?l terdeteksi, namun jumlah tersebut tidak memengaruhi interpretasi hasil ekspresi protein. Secara keseluruhan, penelitian ini menunjukkan bahwa kandidat vaksin mRNA terapeutik berbasis multiepitop HBc dan HBx lintas genotipe VHB dengan adjuvan FliC berhasil dirancang secara rasional, disintesis, dan diekspresikan pada sel mamalia. Hasil ini memberikan proof of concept bahwa desain molekuler dan elemen regulator mRNA mendukung proses translasi intraseluler. Temuan tersebut menjadi landasan untuk pengujian lanjutan pada model praklinis guna mengevaluasi respon imun dan potensi terapeutik terhadap infeksi HBK.