Perpustakaan Digital ITB

Ektoin merupakan osmolit yang banyak digunakan sebagai bahan baku kosmetik karena kemampuannya melindungi kulit manusia dari radiasi ultraviolet, angin, kelembapan udara, dan perubahan suhu ekstrem. Produksi ektoin secara konvensional melalui metode bacterial milking kurang efisien karena menimbulkan korosi peralatan akibat penggunaan garam dalam jumlah besar serta kebutuhan bakteri untuk mempertahankan resistensi osmotik tinggi. Sebagai alternatif, produksi ektoin secara heterolog menggunakan bakteri non-halofil transgenik seperti Escherichia coli BL21(DE3) dapat dikembangkan karena sistem promotor T7 yang kuat memungkinkan ekspresi gen yang lebih efisien. Namun, E. coli secara alami tidak menghasilkan ektoin. Oleh karena itu, diperlukan vektor untuk mengintroduksi gen biosintetik ektoin, pemilihan vektor ini menjadi faktor penting dalam meningkatkan efisiensi produksi. Pada penelitian sebelumnya telah berhasil diisolasi operon gen biosintetik ektoin dari Virgibacillus salarius 19.PP.SC1.6 yang dikombinasikan dengan Ribosome Binding Site (RBS) terkuat. Operon gen biosintetik tersebut kemudian disisipkan ke dalam backbone BASIC SEVA 39.10 yang diperoleh dari Addgene dan hasil desain plasmid sirkuler disintesis oleh Novogene. Namun, kemampuan plasmid tersebut untuk memproduksi ektoin di dalam E. coli BL21(DE3) belum diuji. Penelitian ini bertujuan untuk mengevaluasi kemampuan plasmid tersebut untuk memproduksi ektoin pada E. coli BL21(DE3). Plasmid rekombinan yang dirancang menggunakan operon gen ektoin beserta RBS terkuat, promotor, dan terminator T7 yang disisipkan ke dalam backbone BASIC SEVA 39.10 disebut pECTs. Kompatibilitas operon gen ektoin dari V. salarius 19.PP.SC1.6 untuk diekspresikan ke dalam E. coli BL21(DE3) dilihat juga dengan dihitungnya nilai Codon Adaptation Index (CAI) dan didapatkan angka 0,1 (rentang 0-1) sehingga preferensi kodon E. coli BL21(DE3) berbeda dengan kodon operon gen ektoin dan dapat mengakibatkan rendahnya konsentrasi produk ektoin. Plasmid kemudian disintesis oleh Novogene dan ditransformasi ke dalam E. coli BL21(DE3). Setelah koloni transforman dikonfirmasi, koloni positif diaktivasi dalam medium LB cair mengandung kloramfenikol selama 10 jam, kemudian disubkultur ke dalam 25 mL medium fermentasi (mengandung glukosa, yeast extract, NaCl, KH2PO4, K2HPO4, MgSO4·7H2O, dan kloramfenikol). Induksi dilakukan dengan 0,1 mmol/L IPTG setelah 4 jam, dan fermentasi berlangsung selama 48 jam pada suhu 37°C, 150 rpm, dengan penambahan glukosa 20 gr/L setiap 12 jam. Ektoin didapatkan melalui sentrifugasi untuk memisahkan pelet dan supernatannya, supernatan kemudian dianalisis menggunakan HPLC dengan panjang gelombang DAD 210 nm. Dilakukan pengulangan biologis sebanyak tiga kali untuk produksi ektoin. Hasil HPLC mengonfirmasi keberadaan ektoin dengan terdapatnya puncak sampel pada waktu retensi 4,315–4,323 menit yang mendekati waktu retensi standar (4,311 menit). Konsentrasi ektoin yang diperoleh sebesar 0,03 dan 0,17 mg dalam 25 mL medium dan kemurnian yang didapatkan juga masih rendah. Salah satu dari ketiga sampel yang diuji menghasilkan konsentrasi undefined, hal ini karena konsentrasi ektoin pada sampel di bawah konsentrasi standar. Namun, konsentrasi ektoin yang didapatkan pada penelitian ini lebih tinggi dari konsentrasi ektoin yang didapatkan dari V. salarius 19.PP.SC1.6 dengan metode bacterial milking (0,017 mg/25 mL), hal ini dikarenakan telah dilakukan optimalisasi sistem promotor-terminator dan induksi untuk ekspresi gen pada E. coli secara terus menerus. Walau begitu, konsentrasi ektoin yang dihasilkan pada penelitian ini masih cukup rendah jika dibandingkan dengan konsentrasi ektoin dari E. coli rekombinan yang telah dilaporkan. Konsentrasi yang rendah dan tidak konsisten ini diduga terkait konversi prekursor menjadi produk yang tidak maksimal karena ekspresi enzim biosintesis ektoin yang rendah yang didorong dengan penggunan ORI dengan low copy number dan kompetisi jalur biosintesis ektoin dengan jalur lain yang memiliki prekursor yang sama. Nilai CAI yang rendah juga menyebabkan translasi menjadi enzim biosintesis ektoin tidak maksimal. Konversi prekursor menjadi produk yang tidak maksimal ini juga menyebabkan prekursor menumpuk dan terbaca pada analisis HPLC sebagai residu. Berdasarkan hasil yang didapatkan pada penelitian ini, dapat disimpulkan bahwa pECTs dapat menghasilkan ektoin, walau begitu konsentrasi dan kemurnian ektoin masih perlu ditingkatkan. Penelitian lanjutan dapat berfokus pada optimasi kodon, analisis ekspresi gen biosintetik ektoin, dan optimasi konstruk plasmid.