Streptococcus mutans merupakan patogen penyebab karies, sedangkan Enterococcus faecalis menyebabkan periodontitis apikalis kronis pada saluran akar gigi. Produk kesehatan gigi umumnya mengandung surfaktan jenis Sodium Lauryl Sulfate (SLS), namun penggunaannya dibatasi karena toksisitasnya yang tinggi sehingga dapat menyebabkan inflamasi pada jaringan mulut. Biosurfaktan memiliki potensi sebagai alternatif pengganti SLS. Selain biosurfaktan, minyak atsiri juga menjadi salah satu bahan yang digunakan dalam produk kesehatan gigi. Minyak atsiri kayu manis memiliki kemampuan sebagai antibakteri dan antibiofilm. Penelitian ini bertujuan untuk menapis isolat penghasil biosurfaktan yang paling efektif sebagai agen antibakteri terhadap S. mutans dan E. faecalis, mengkarakterisasi senyawa biosurfaktan terpilih dari hasil penapisan, menentukan konsentrasi minimum minyak atsiri kayu manis sebagai agen antibakteri, menentukan konsentrasi biosurfaktan, minyak atsiri kayu manis, dan kombinasi keduanya sebagai agen antibiofilm, serta menguji kebocoran kalium pada S. mutans dan E. faecalis yang diberi biosurfaktan, minyak atsiri kayu manis, dan kombinasi keduanya. Pada tahap awal dilakukan identifikasi dan seleksi bakteri penghasil biosurfaktan melalui uji Minimal Inhibitory Concentration (MIC) terhadap S. mutans dan E. faecalis. Karakterisasi biosurfaktan dari isolat bakteri terpilih kemudian dilakukan melalui analisis Fourier transform infrared (FTIR), Liquid chromatography–mass spectrometry (LC-MS), dan Interfacial tension. Selanjutnya dilakukan penentuan konsentrasi minimum minyak atsiri kayu manis sebagai agen antibakteri. Kemudian pengujian antibiofilm dilakukan dengan melihat nilai Minimum Biofilm Inhibitory Concentration (MBIC) dan Minimum Biofilm Eradication Concentration (MBEC) serta visualisasi biofilm dengan mikroskop flourensens. Tahapan akhir dari penelitian ini yaitu dengan mengamati kebocoran kalium pada S. mutans dan E. faecalis yang telah diberi biosurfaktan, minyak atsiri kayu manis, dan kombinasi keduanya menggunakan Atomic Absorption Spectrophotometer (AAS). Dari hasil seleksi lima isolat bakteri, isolat Bacillus siamensis menunjukkan aktivitas penghambatan paling efektif terhadap S. mutans dan E. faecalis. Berdasarkan hasil karakteristik FTIR dan LC-MS, biosurfaktan yang dihasilkan tergolong dalam kelompok glikolipid dengan struktur kimia mirip rhamnolipid dan memiliki nilai Critical Micelle Concentration sebesar 0,1 g/L. Minyak atsiri kayu manis menunjukkan aktivitas antibakteri pada S. mutans dan E. faecalis pada konsentrasi 500 ppm. Biosurfaktan merupakan agen-antiadhesi dan eradikasi terhadap S. mutans dan E. faecalis pada konsentrasi 125 ppm dengan persentase diatas 10%. Minyak atsiri kayu manis merupakan agen-antiadhesi dan eradikasi terhadap S. mutans dan E. faecalis pada konsentrasi 1000 ppm dengan persentase diatas 10%. Kombinasi dari biosurfaktan pada konsentrasi 62,5 ppm dan minyak atsiri kayu manis 4000 ppm dapat digunakan sebagai agen anti-adhesi dan eradikasi terhadap S. mutans dan E. faecalis dengan persentase diatas 25%. Analisis menggunakan AAS menunjukkan peningkatan kandungan kalium pada supernatan dari kedua bakteri uji setelah pemberian biosurfaktan, minyak atsiri kayu manis, maupun kombinasi keduanya jika dibandingkan dengan kandungan kalium kontrol (p value<0,5). Hasil penelitian menunjukkan bahwa biosurfaktan, minyak atsiri kayu manis dan kombinasi keduanya berpotensi untuk digunakan sebagai antibakteri dan antibiofilm yang efektif terhadap S. mutans dan E. faecalis.