Asam lemak omega-3 khususnya asam dokosaheksaenoat (DHA) tergolong asam lemak fungsional yang sangat bermanfaat bagi kesehatan. Selama ini sumber utama DHA diperoleh dari ikan yang diekstrak menjadi minyak ikan. Namun karena keterbatasan dalam kemurnian, kontaminasi logam berat, penerimaan konsumen dan proses produksinya, maka dicari alternatif baru sumber DHA diantaranya adalah mikroalga heterotrof. Penelitian 'ini _&ertujuan untuk mengisolasi mikroalga heterotrof dan karakterisasinya sebagai sumber DHA dari kawasan mangrove Cilacap. Mikroalga heterotrof dfisolasi dari serasah daun mangrove (Rhizophora apiculata) dengan metode direct planting. Koloni mikroalga diamati morfologinya dengan mikroskop cahaya kemudian dipurifikasi sehingga dihasilkan koloni tunggal yang selanjutnya difermentasi selama 14 hari untuk diproduksi biomassanya. Asam lemak diekstraksi dan dimetilasi dengan metode transesterifikasi in-situ serta diidentifikasi kandungan DHA dengan menggunakan Kromatografi Gas. Hasil isolasi diperoleh empat isolat mikroalga heterotrof yaitu MTKCI, MTKC2, MTKC3, MTKC4. Dari keempat tersebut isolat MTKC2 yang terdeteksi memperoduksi DHA dengan kadar 9,20%. Isolat MTKC2 yang memproduksi DHA diidentifikasi dan dikarakterisasi lebih lanjut secara biologi molekuler. Hasil identifikasi menunjukkan termasuk genus Thraustochytrium.