Perpustakaan Digital ITB

Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats associated 9 (CRISPR-Cas9) merupakan salah satu teknik modifikasi genetik yang efektif dan efisien. Sistem ini tersusun atas Single-Guide RNA (sgRNA) yang dapat didesain untuk menarget sekuens DNA spesifik serta protein Cas9 dengan aktivitas endonuklease. Saat ini sistem CRISPR-Cas9 telah dikembangkan aplikasinya dalam bidang rekayasa genetika. Sistem pengantaran protein Cas9 dan sgRNA dalam bentuk ribonukleoprotein (RNP) lebih diminati karena memiliki efek imunogenitas dan potensi off-target yang lebih rendah. Namun protein Cas9 memiliki ukuran yang relatif besar (158 kDa) memicu kecenderungan terbentuknya agregasi protein Cas9 non-fungsional pada produksi protein rekombinan dengan E. coli. Salah satu pendekatan untuk menghasilkan protein soluble dan fungsional adalah menggunakan Chaperone-Substrate Co-Localized Expression (CLEX). Metode ini akan diadaptasi untuk meningkatkan persentase protein Cas9 rekombinan fungsional. Dirancang satu area tumpang-tindih antara urutan DNA yang mengkodekan protein Cas9 dengan chaperone DnaJ. Sistem ini disusun dengan tujuan meningkatkan efisiensi pelipatan protein Cas9 melalui peningkatan probabilitas interaksi antara protein Cas9 dan chaperone DnaJ. Kedua coding region tersebut diintegrasikan di dalam vektor ekspresi pRSFDuet-1 dengan inang ekspresi berupa E. coli BL21(DE3). Pengujian dilakukan dengan menganalisis persentase relatif Cas9 soluble yang diproduksi dengan dan tanpa sistem CLEX berdasarkan hasil SDS-PAGE. Hasil menunjukkan bahwa persentase protein Cas9 soluble yang diproduksi melalui sistem CLEX tidak lebih tinggi dari pada produksi kontrol (tanpa CLEX). Hal ini diduga karena besarnya ukuran protein target dan beban metabolik yang meningkat dengan penambahan sistem CLEX. Pengujian menunjukkan temperatur (18, 25, 30 dan 37 oC) dan durasi ekspresi (4, 6 dan 16 jam) menjadi faktor signifikan yang mendeterminasi persentase kelarutan protein target Cas9. Terjadi penurunan persentase relatif Cas9 soluble pada sistem dengan dan tanpa CLEX seiring pertambahan suhu dan durasi ekspresi. Namun didapatkan bahwa dengan sistem CLEX diperoleh persentase Cas9 soluble yang lebih tinggi dibandingkan sistem tanpa CLEX pada suhu 30 oC dan durasi ekspresi 16 jam. Sehingga sistem ini dapat diaplikasikan untuk mengekspresikan protein tanpa pengggunaan inkubator ruang dingin pada durasi yang panjang dan kontinu. Hasil regresi linear juga menunjukkan bahwa sistem CLEX memperlambat pembentukan fraksi insoluble seiring bertambahnya suhu dan durasi ekspresi. Pengujian aktivitas endonuklease pada protein Cas9 yang diproduksi dengan dan tanpa sistem CLEX menunjukkan bahwa aktivitas endonuklease secara in vitro keduanya tidak berbeda.