Perpustakaan Digital ITB

LK1, LK2 dan LK3 adalah gen lipase yang diperoleh dari hasil metagenom sampel kompos. Gen yang mengkode lipase ini telah disimpan di GenBank dengan nomor akses berturut-turut KP204883, KP204884, KP204885. Ekspresi gen lipase LK1, LK2 dan LK3 pada vektor ekspresi pET30a(+) dalam inang Eschericia coli yang diinduksi dengan IPTG dilakukan untuk memperoleh protein lipase rekombinan. Enantiomer asam mandelat dan turunannya telah dianggap sebagai zat penting karena digunakan secara luas untuk tujuan sintetik. (R)-asam mandelat digunakan untuk membuat antibiotik seperti sefalosporin dan penisilin semisintetik sedngkan (S)-asam mandelat digunakan untuk membuat obat antiinflamasi seperti deracoxib dan celecoxib. Kelebihan enansiomer tunggal adalah selektivitas yang lebih besar untuk target biologisnya, indeks terapeutik yang lebih baik, farmakokinetik yang lebih baik daripada campuran enansiomer, efek samping yang berkurang akibat aktivitas enansiomer yang tidak diinginkan. Penelitian ini bertujuan untuk memperoleh lipase yang bersifat sebagai biokatalis enansioselektif terhadap (R-S)-asam mandelat Enansioselektivitas lipase LK1, LK2, LK3 diukur dengan menggunakan HPLC kolom kiral dimana sebelumnya telah dilakukan optimasi terhadap fasa gerak heksan: isopropanol, laju alir 1 mL/menit, suhu kolom 30oC dan penambahan TFA 4% dan juga validasi metode untuk memastikan bahwa pengujian yang akan dilakukan sudah sesuai dengan prasyarat pengujian. Hasil validasi metode menunjukkan persen perolehan kembali sebesar 100,06 untuk enansiomer R dan 100.10 untuk enansiomer S dengan % standar deviasi relatif masing-masing sebesar 0,482% dan 0,318 %. Hal ini menunjukkan bahwa metode analisa yang digunakan memberikan data yang mendekati nilai sebenarnya. Pemisahan campuran rasemat (R-S) asam Mandelat dengan kondisi ini menghasilkan dua puncak terpisah dengan puncak pertama yang muncul adalah puncak dari enansiomer (S)-asam Mandelat dan puncak kedua adalah puncak enansiomer (R)-asam Mandelat. Hal ini sejalan dengan studi komputasinya yang menunjukkan bahwa affinitas kompleks kolom dengan ligan R lebih stabil dibandingkan kompleks kolom dengan ligan S. Reaksi transesterifikasi antara vinil asetat dengan (R-S)-asam Mandelat yang dikatalisis oleh ketiga lipase diatas di inkubasi pada rentang suhu antara 45-65. Enansioselektifitas diikuti dengan menghitung enantiomeric excess (ee), yang menunjukkan angka banding enansiomer dominan terhadap campuran rasemat. Data pengamatan menunjukkan profil grafik antara suhu yang khas. Dari pola itu teramati ada 2 titik penting yang diperoleh yaitu suhu optimum dan suhu minimum. Pada suhu optimum, diperoleh nilai enansiomerik ekses yang paling maksimum. Suhu optimum pada LK1 terdapat pada suhu 45 oC dengan nilai enansiomerik ekses sebesar 10,2 %, LK2 terdapat pada suhu 65 oC dengan enansiomerik ekses sebesar 12,3% dan LK3 terdapat pada suhu 60 oC dengan enansiomerik ekses sebesar 13,3%. Sedangkan pada suhu minimum LK1 terdapat pada suhu 55 oC (enansiomerik ekses 3,4%), LK2 terdapat pada suhu 55oC (enansiomerik ekses 3,2%) dan LK3 terdapat pada suhu 55 oC (enansiomerik ekses 0,6%). Pengukuran ini dilakukan dengan menggunakan HPLC kolom kiral dengan parameter hasil optimasi. Dari hasil pendekatan komputasi doking dengan Autodock Vina dan MD diperoleh bahwa enansiomer (R)-asam mandelat berinteraksi lebih kuat dibandingkan dengan enansiomer (S)-asam mandelat. Dapat dilihat dari nilai energi pengikatan enansiomer yang lebih rendah dibanding enansiomer S untuk lipase LK1, LK2 dan LK3. Pada kompleks enzim LK1-R, residu sisi aktif (Ser109, Asp255, His277) berikatan dengan ligan. Sedangkan pada kompleks enzim LK1-S residu sisi aktif tidak berikatan dengan ligan. Hal ini memungkinkan yang bereaksi dengan vinil asetat adalah enansiomer R. Kompleks LK2-R memiliki residu sisi aktif (Ser109, Asp255, His277) yang berikatan dengan ligan sedangkan kompleks enzim LK2-S residu sisi aktif tidak berikatan dengan ligan. Pada lipase LK3, kompleks enzim LK3-R memiliki residu sisi aktif (Ser109, Asp255, His277) yang berikatan dengan ligan sedangkan kompleks sedangkan kompleks enzim LK3-S ligan hanya berikatan dengan His277 dan Asp 255 Hal ini sejalan dengan hasil eksperimen yang menunjukkan bahwa enansiomer yang dikonversi menjadi produk dilihat dari pengurangan substrat enansiomer R-nya. Ikatan hidrogen pada enansiomer R pada Lk1, Lk2 dan Lk3 lebih banyak dibandingkan dengan enansiomer S. Pada suhu optimum, lipase isolat lokal LK1, LK2 dan LK3 memiliki pemisahan enansiomer lebih baik, hal ini dikarenakan dipengaruhi oleh residu spesifisitas masing-masing isolat. Pada LK1 dipengaruhi oleh residu spesifisitas Ala217 dan Leu220. Pada LK2 dipengaruhi oleh residu spesifisitas Leu205 dan Asn207. Sedangkan pada LK3 dipengaruhi oleh residu spesifisitas Leu205 dan Met210. Hasil eksperimen sejalan dengan studi komputasi. Sedangkan pada suhu minimum dapat dikatakan bahwa enzim tidak dapat membedakan antara enansiomer R dan S. Residu-residu spesifisitas yang terlibat pada reaksi di suhu optimum tidak ditemukan pada suhu minimum.