Perpustakaan Digital ITB

Pada tahun 2019, Indonesia mengalami penurunan kuantitas produksi tanaman cabai (Capsicum annuum L.) dibanding tahun 2018. Penurunan ini salah satunya disebabkan oleh tingginya suseptibilitas tanaman Capsicum annuum L. terhadap patogen seperti Potyvirus. Diketahui bahwa protein eIF4E cabai memfasilitasi replikasi Potyvirus pada sel tanaman, sehingga knockout gen ini diduga mampu meningkatkan resistensi cabai terhadap Potyvirus. Peningkatan resistensi tanaman melalui metode bebas transegnik, seperti CRISPR-Cas9 dapat menjadi salah satu solusi karena tidak diperlukan insersi dari gen asing. Sitem modifikasi gen CRISPR-Cas9 tersusun atas protein yang memiliki domain katalitik endonuklease dengan dan sgRNA yang terinkorporasi dan menentukan spesifisitas dari kompleks Ribonukleoprotein (RNP). Maka penelitian ini ditujukan untuk mendesain sgRNA, menentukan konsentrasi IPTG optimum dalam proses produksi protein Cas9, dan mengonfirmasi aktivitas endonuklease secara in vitro dari kompleks Cas9-RNP yang diproduksi. Dalam menarget gen eIF4E cabai, berhasil disusun satu sgRNA yang akan memotong pada tiga basa upstream dari basa ke 196 yang merupakan sekuens Protospacer Adjacent Motif (PAM). Target ini juga berada pada ekson pertama tanpa potensi off-target. Proses produksi Cas9 sendiri dapat dilakukan dengan menggunakan casis berupa bakteri Escherichia coli BL21(DE3) menggunakan plasmid 4xNLS-pMJ915v2-sfGFP yang dideposit dari Addgene (#88921). Pada plasmid ini, ekspresi protein Cas9 diregulasi oleh promoter T7 yang diinduksi oleh IPTG. Didapatkan bahwa konsentrasi optimum IPTG untuk menginduksi ekspresi Cas9 fungsional pada fraksi sitoplasmik adalah 500 ?M. Proses purifikasi juga menunjukkan bahwa protein Cas9 dapat ditemukan hingga fraksi elusi kedua (2 mL) dengan menggunakan kolom purifikasi Ni-NTA. Namun, proses purifikasi menggunakan His-tag masih belum cukup untuk memisahkan protein Cas9 karena masih ditemukan banyak protein pengotor yang terlihat setelah dilakukan pemekatan dengan menggunakan proses ultrafiltrasi protein. Hasil dari Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) menunjukkan keberhasilan pembentukan kompleks Cas9-RNP. Kedua protein Cas9 dengan atau tanpa Maltose Binding Protein (MBP) yang dipotong menggunakan TEV protease menunjukkan aktivitas endonuklease secara in vitro yang sama terhadap eIF4E. Pada penelitian selanjutnya, disarankan untuk menguji aktivitas secara in vivo dan optimasi proses purifikasi protein Cas9.