Perpustakaan Digital ITB

Siklodekstrin glukanotransferase (CGTase, EC. 2.4.1.19) merupakan enzim yang mengkatalisis pembentukan siklodekstrin (CD) dari pati. Bentuk CD yang unik menjadikannya sering digunakan dalam formulasi obat. Bacillus sp. LT1B dan PT2B merupakan bakteri penghasil CGTase asal Indonesia yang berhasil diisolasi dan dikarakterisasi di Laboratorium Bioteknologi Farmasi ITB. Karakter enzim dari kedua isolat berpotensi untuk memproduksi CD pada skala industri. Penelitian ini bertujuan untuk melakukan kloning DNA pengkode CGTase tanpa sinyal peptida dari kedua isolat lokal tersebut ke vektor ekpresi pET-16b_rec dan mengkarakterisasi produk ekspresinya. Kloning DNA pengkode CGTase tanpa sinyal peptida dilakukan dengan metode QuickStep Cloning. Perbaikan urutan DNA hasil kloning dilakukan dengan metode SDM SPRINP-PCR. Konfirmasi hasil dianalisis dengan pembacaan urutan DNA. Kondisi produksi CGTase rekombinan (rCGTase) dioptimasi meliputi jumlah induser IPTG, suhu dan waktu induksi. Analisa hasil produksi rCGTase dilakukan menggunakan SDS-PAGE untuk mengkarakterisasi ukuran dan zimografi untuk mengetahui aktivitasnya. Pada tahap kloning, pembentukan megaprimer dilakukan dengan primer For_QS dan MR (megaprimer untai I), dan primer Rev_QS dan MF (megaprimer untai II). Rasio konsentrasi primer optimal untuk membentuk megaprimer I dan II berturutturut 25:1 (50 °C) dan 20:1 (53 °C). Rekombinasi megaprimer ke vektor dilakukan pada suhu penempelan 52 °C. Kondisi overproduksi rCGTase optimal adalah 37 °C selama 3 jam dengan penggunaan konsentrasi akhir IPTG 0,1 mM. rCGTase dihasilkan dalam bentuk badan inklusi dan berhasil disolubilisasi dengan urea 8 M sebanyak 1,5 mL/110 mg pelet. Pelipatan kembali dan pemurnian protein dilakukan pada kolom afinitas nikel secara simultan. Ukuran eksperimental kedua enzim adalah 78,2 kDa (LT1B) dan 77,5 kDa (PT2B). Hasil analisis zimografi menunjukkan rCGTase hasil pelipatan kembali positif memiliki aktivitas hidrolisis pati dan siklisasi-?.