Perpustakaan Digital ITB

?-Amilase (EC 3.2.1.1) menghidrolisis ikatan ?-1,4-glikosidik pada pati menghasilkan campuran oligosakarida. BmaN2 merupakan salah satu ?-amilase yang diperoleh dari Bacillus megaterium NL3, suatu isolat dari Danau Kakaban Indonesia. Berdasarkan analisis kekerabatan urutan asam amino keluarga ?-amilase, residu asam amino asparagin nomor 205 (N205) BmaN2 berada pada daerah pengikatan ion kalsium, tetapi fungsinya belum diketahui dengan pasti. Penelitian ini bertujuan untuk mempelajari peran N205 terhadap aktivitas BmaN2. Site directed mutagenesis digunakan untuk mengubah N205 menjadi alanin (N205A) dan menjadi asam aspartat (N205D). Escherichia coli TOP10F’ sebagai sel inang kloning ditransformasi dengan pET30a-bmaN2 N205A dan pET30a- bmaN2 N205D. Keberhasilan mutasi BmaN2 N205A dan BmaN2 N205D dipastikan dengan sekuensing. Berdasarkan hasil sekuensing, urutan asam amino BmaN2 telah berubah sesuai yang diinginkan, yaitu BmaN2 N205A dan BmaN2 N205D. Kodon asparagin (AAT) berubah menjadi kodon alanin (GCG) pada pET30a-bmaN2 N205A dan menjadi kodon asam aspartat (GAT) pada pET30a-bmaN2 N205D. Escherichia coli BL21(DE3) sebagai sel inang ekspresi ditransformasi dengan pET30a-bmaN2 N205A dan pET30a-bmaN2 N205D. Ekspresi bmaN2, bmaN2 N205A, dan bmaN2 N205D dilakukan dengan induksi IPTG 0,1 mM pada suhu ruang selama 3 jam 30 menit. BmaN2 wild type, BmaN2 N205A, dan BmaN2 N205D memiliki ukuran ± 62 kDa. Aktivitas ekstrak kasar BmaN2 wild type, BmaN2 N205A, dan BmaN2 N205D diuji dengan metode asam 3,5- dinitrosalisilat (DNS) menggunakan substrat larutan pati 1% (b/v), secara berurutan menghasilkan nilai aktivitas lisat sebesar 11,53 ± 0,06, 5,54 ± 0,06, dan 25,05 ± 0,18 U/mg. Protein BmaN2 wild type, BmaN2 N205A, dan BmaN2 N205D berhasil dimurnikan menggunakan metode kromatografi afinitas Ni-NTA menghasilkan pita tunggal pada elektroforegram SDS-PAGE. Berdasarkan analisis bioinformatika dan aktivitas enzim, N205 diprediksi sebagai residu yang mempengaruhi aktivitas enzim.