Perpustakaan Digital ITB

Reverse transcriptase (RT) merupakan enzim yang dapat mengkatalisisasi sintesis cDNA dari template RNA. Salah satu RT yang paling umum digunakan adalah moloney murine leukemia virus reverse transcriptase (MMLV RT) yang masih memiliki prosesivitas dan termostabilitas yang rendah. Pada penelitian sebelumnya dilakukan fusi MMLV RT dengan protein Sis7a dari 7 kDa DNA binding protein family yang berhasil meningkatkan termostabilitas, parameter fisikokimia, dan lebih hidrofilik dibandingkan dengan RT komersial (RTK). Namun, produksi MMLV RT fusi masih dilakukan dalam skala kecil, yakni 80 mL. Maka dari itu, dalam penelitian ini dilakukan produksi MMLV RT fusi dalam skala yang lebih besar, yakni 330 mL volume kultur. Yield (konsentrasi protein) dan aktivitas enzim kemudian diukur untuk menentukan kondisi produksi terbaik. MMLV RT fusi diekspresikan pada Escherichia coli (E. coli) BL21(DE3) dengan dan tanpa induksi isopropil ?-D-1-tiogalaktopiranosid (IPTG) selama 24 jam. Saat inkubasi, dilakukan pengukuran pH, OD600, berat kering sel (dry cell weight/DCW) serta ekstraksi MMLV RT fusi setiap 6 jam sekali yang kemudian diuji aktivitasnya. Selain itu, uji aktivitas juga dilakukan dengan membandingkan kultur setelah inkubasi 24 jam dengan metode pemekatan presipitasi dengan aseton dan ultra centrifugal filters. Aktivitas enzim kemudian diukur dengan menggunakan two step RT-qPCR pada protein yang dipurifikasi dengan kolom Ni-NTA dan tidak dipurifikasi (ekstrak kasar). Setelah 24 jam inkubasi, pertumbuhan E. coli BL21(DE3) rekombinan MMLV RT fusi, baik diinduksi maupun tidak, meningkat ditunjukkan oleh kenaikan OD600 dan DCW. Kepadatan sel (OD600 = 1,4725) dan DCW (1,1 mg) kultur yang tidak diinduksi tertinggi pada jam ke-18 sementara pada kultur yang diinduksi (OD600 = 1,5775, DCW = 1.3 mg) diperoleh tertinggi pada jam ke-24 (fase stasioner). Selama 24 jam, pH kedua kultur menurun selama fase log, dan kemudian meningkat saat memasuki fase stasioner yang menandakan adanya perubahan metabolit untuk menghasilkan produk. Berdasarkan hasil uji aktivitas, diperoleh aktivitas MMLV RT fusi tertinggi (Cq = 25,9) saat diinkubasi selama 24 jam dan tanpa induksi. MMLV RT fusi yang tidak dipurifikasi menghasilkan aktivitas yang lebih tinggi (Cq = 31,07) dibandingkan dengan MMLV RT fusi yang dipurifikasi. Sementara itu, kedua proses pemekatan yang berbeda tidak menunjukkan metode yang lebih baik dalam memengaruhi hasil uji aktivitas. Secara keseluruhan, kondisi produksi MMLV RT fusi paling optimal diperoleh ketika sel dipanen saat fase stasioner akhir tanpa induksi dan tanpa purifikasi. .