Perpustakaan Digital ITB

Reverse transcriptase (RT) merupakan enzim yang berperan dalam mengkatalis reaksi konversi RNA menjadi complementary DNA (cDNA). Enzim ini banyak digunakan dalam diagnostik molekuler dan experimental workflow berbasis RNA lainnya. Akan tetapi enzim komersial yang sudah ada memiliki prosesivitas yang rendah dan bersifat termolabil. Pada penelitian sebelumnya telah dirancang enzim rekombinan Moloney Murine Leukemia Virus RT (MMLV RT) yang difusikan dengan protein Sis7a dari Sulfolobus islandicus (MMLV RT Sis7a) untuk meningkatkan prosesivitas dan termostabilitas enzim tersebut. Kondisi optimal seperti bufer reaksi, bufer penyimpanan, dan suhu penyimpanan enzim rekombinan ini belum dikarakterisasi. Bufer yang umum digunakan pada enzim ini adalah bufer berbasis Tris-Cl yang dikombinasikan dengan komponen lain seperti KCl, MgCl2, dan DTT untuk bufer reaksi serta NaCl, EDTA, Triton X-100, dan DTT untuk bufer penyimpanan. Komponen penting dalam bufer reaksi adalah KCl yang berperan dalam reaksi hidrolisis RNA oleh RNAse H dan NaCl berperan dalam kestabilan enzim. Konsentrasi ion monovalen ini perlu dioptimalkan untuk setiap enzim RT. Oleh karena itu, pada penelitian ini dilakukan optimasi bufer untuk kedua komponen ion tersebut. PCR koloni dilakukan untuk mengkonfirmasi plasmid rekombinan MMLV-RT-Sis7a pada E. coli BL21 (DE3). Produksi enzim dilakukan pada suhu 25oC dengan induksi IPTG 0,5 mM selama 16 jam dan divisualisasi pada gel SDS-PAGE. Fraksi protein terlarut dipurifikasi menggunakan kolom Ni-NTA dan elusi dipekatkan menggunakan konsentrator. Pengujian aktivitas enzim dilakukan menggunakan kit EnzChek™ Reverse Transcriptase Assay. Pertama dilakukan penentuan bufer reaksi dengan variasi konsentrasi KCl (50, 75, dan 100 mM) yang dikombinasikan dengan seluruh variasi bufer penyimpanan dengan variasi konsentrasi NaCl (50, 100, dan 150 mM). Bufer reaksi optimal digunakan seterusnya untuk pengujian bufer penyimpanan selama 3 bulan (titik sampling 0, 2, 4, 8, dan 12 minggu) yang disimpan pada suhu -20, 4, dan 25oC. Plasmid rekombinan berhasil dikonfirmasi dengan amplikon berukuran ~2,5 kb. Enzim berhasil diproduksi, dipurifikasi dan dipekatkan yang ditandai dengan keberadaan pita protein berukuran ~82 kDa pada gel SDS-PAGE. Berdasarkan data fluoresensi, bufer reaksi optimal adalah menggunakan KCl 50 mM. Namun, ketiga variasi konsentrasi NaCl yang digunakan sebagai bufer penyimpanan menyebabkan penurunan fluoresensi pada pengujian selama 3 bulan sehingga konsentrasi NaCl optimla dipilih berdasarkan persentase penurunan fluoresensi terendah yaitu NaCl 50 mM yang disimpan pada suhu -20°C dengan rata-rata penurunan 22,61%. Oleh karena itu, pada penelitian ini diperoleh bufer reaksi optimal untuk enzim MMLV-RT-Sis7a tetapi untuk komponen bufer penyimpanan perlu diteliti lebih lanjut. Selain itu perlu diteliti variasi komponen bufer lainnya yang dapat divariasikan dan belum dilakukan pada penelitian ini.