Perpustakaan Digital ITB

Spesiasi unsur (elemental speciation) merupakan salah satu topik utama dalam penelitian bidang kimia analitik, terutama untuk memenuhi kebutuhan informasi tentang perilaku dan karakter suatu unsur misalnya mobilitas, fungsi, ketersediaan, defisiensi dan toksisitasnya. Perilaku suatu unsur baik pada organisme maupun pada sistem ekologis tidak dapat diterangkan hanya dengan mengetahui jumlah total unsur tersebut dalam sampel yang bersesuaian melainkan juga ditentukan oleh bentuk spesi unsur tersebut. Pada tanaman, sejumlah unsur dengan berbagai bentuk spesi kimia diperlukan untuk pertumbuhan, misalnya unsur Mg dan Ca sebagai unsur hara pokok, dan Mn, Zn, dan Mo sebagai unsur hara runut. Fungsi dan peranan unsur tersebut dalam tanaman telah diketahui dengan jelas, namun bagaimana spesiasi kimia unsur tersebut belum terungkapkan sepenuhnya. Berdasarkan latar belakang tersebut di atas, telah dilakukan spesiasi unsur Mg, Ca, Mn, Zn, Mo, dan Cd dalam cairan floem tanaman jarak (Ricinus communis L.), dengan target utama diferensiasi dan distribusi spesi kimia unsur hara pokok Mg dan Ca, spesi kimia unsur hara runut Mn, Zn, dan Mo serta spesi kimia logam berat (Cd) dalam sampel tersebut. Penelitian ini difokuskan pada analisis spesiasi operasional, yaitu karakterisasi spesi yang tergantung pada metode analitik yang dipilih. Metode pemisahan utama dilakukan dengan menggunakan kromatografi eksklusi ukuran (size exclusion chromatography, SEC) sedangkan metode pemisahan pendukung adalah quantitative preparative native continuous polyacrylamide gel electrophoresis (QPNC PAGE). Pemisahan dua tahap (bidimensional) spesi Mo dilakukan dengan menggunakan kedua metode tersebut. Adapun pemisahan dua tahap spesi Ca, tahap pertama dengan SEC dan tahap kedua dengan elektroforesis kapiler (capillary electrophoresis, CE). Pendeteksian selektif unsur dilakukan dengan inductively coupled plasma quadrupole mass spectrometry (ICP QMS). Khusus untuk spesi Mo dilakukan pendeteksian selektif molekul dengan electrospray ionization –mass spectrometry (ESI MS). Dengan menggunakan metode SEC, spesi Mg, Ca, Mn, Zn, Mo, dan Cd terdistribusi berdasarkan perbedaan berat molekul relatifnya. Kolom pemisah yang digunakan adalah sephadex G-50 SF (700 mm x 24 mm) dan sephadex G-25 M (28 mm x 9 mm). Sebagai fasa gerak digunakan larutan 20 mM MES/1 mM NaN3 pH 8,0 dan larutan 20 mM NaCl/1 mM NaN3 pH 8,0. Kondisi operasional yang diaplikasikan pada kolom sephadex G-50 SF meliputi (i) laju alir 0,3 mL/min, (ii) volume fraksi 7,2 mL, jumlah fraksi 95 (fraksinasi berlangsung otomatis), (iii) pendeteksian UV pada panjang gelombang 254 nm, dan (iv) temperatur pemisahan 4 derajat C, sedangkan pada kolom sephadex G-25 M dilakukan pada kondisi: (i) laju alir 0,3 mL/min, (ii) volume fraksi 0,1-0,2 mL, (iii) jumlah fraksi 20-40 (manual), dan (iv) temperatur pemisahan pada temperatur ruang. Kalibrasi kolom sephadex G-50 SF dilakukan dengan menggunakan campuran standar protein thyroglobulin (670 kDa), γ-globulin (158 kDa), ovalbumin (44 kDa), myoglobin (17 kDa), dan Vitamin B12 (1,35 kDa). Spesi yang terdeteksi setelah pemisahan dengan kolom sephadex G-50 SF dan kolom sephadex G-25 M berturut-turut diberi notasi subscript A dan subscript B. Subscript A1, A2, dan seterusnya menyatakan urutan spesi dari logam yang sama berdasarkan urutan berat molekul relatifnya. Metode QPNC PAGE diaplikasikan juga dalam penelitian ini untuk melihat profil elusi spesi unsur berdasarkan berbedaan m/z spesi. Kondisi operasional yang diterapkan meliputi (i) sistem buffer kontinyu 20 mM Tris-HCl/1 mM NaN3 pH 10, (ii) derajat polimerisasi poliakrilamid 4 %T / 2,67 % C, panjang gel 40 mm, fasa gerak 20 mM MES/1 mM NaN3 pH 8,0, dan (iii) temperatur analisis 4 derajat C. Sampel difraksinasi sebanyak 74 fraksi dengan volume setiap fraksi 5 mL (fraksinasi otomatis dengan pemograman). Pemisahan tahap dua spesi Ca dilakukan dengan menggunakan elektroforesis kapiler. Prinsip pemisahan CE adalah berdasarkan perbedaan mobilitas analit pada suatu medan listrik tertentu. Medan listrik diaplikasikan sepanjang kolom kapiler pada tegangan tinggi (15-30 kV) pada elektroda positif atau negatif. Pemisahan analit terjadi sebagai hasil pergerakan analit di bawah pengaruh fenomena elektroosmotik dan elektroforetik. Untuk mendapatkan metode pemisahan yang optimal dilakukan optimasi: komposisi dan konsentrasi buffer, pH, tegangan yang diaplikasikan, dan penggunaan surfaktan sebagai modifikator laju elektroosmotik. Pendeteksian selektif unsur dalam cairan floem tanaman jarak dan dalam fraksi SEC dan QPNC PAGE dilakukan dengan ICP QMS. Prinsip kerja metode ICP QMS adalah analit diionisasi dalam plasma menjadi muatan positif satu yang kemudian dicacah jumlahnya oleh spektrometri massa quadrupole. Kondisi operasional yang diaplikasikan antara lain (i) daya 880-1200 Watt, (ii) sistem detektor pulsa dan analog, (iii) laju gas argon pembawa 14 L/min, (iv) laju gas argon pengabut 0,9-0,98 L/min, (v) laju sampel 1,2 mL/min, (vi) pengolahan sinyal peak hopping, (vii) sweeps/reading 35-40/3-5, (viii) replikasi 5 kali, (ix) sample flush 45 detik, (x) read delay 15 detik, (xi) wash time 60 detik, dan (xii) standar internal 10 μg/L In dalam HNO3 1 % (b/b). Pengujian kemungkinan interaksi logam dengan protein/polipeptida diuji dengan menggunakan proteinase K. Cairan floem sebelum dan sesudah destruksi dengan proteinase K difraksinasi menggunakan kolom sephadex G-25 M kemudian secara selektif unsurnya dideteksi dengan ICP QMS. Konsentrasi protein dalam fraksi ditentukan berdasarkan metode Bradford. Profil elusi logam dalam fraksi sebelum dan sesudah destruksi proteinase dibandingkan untuk melihat kemungkinan adanya interaksi logam dengan protein/polipeptida. Hasil penelitian menunjukkan ada 6 kelompok spesi aktif UV berdasarkan profil serapan UV cairan floem pada kolom sephadex G-50 SF. Ke-enam kelompok aktif tersebut meliputi satu kelompok (kelompok A) terdeteksi pada daerah berat molekul tinggi (> 44 kDa) dan lima lainnya (kelompok B, C, D, E dan F) pada daerah berat molekul rendah. Sebagai hasil penelitian terdeteksi dua spesi karbon yaitu spesi CA1 dan CA2, 4 spesi fosfor, PA1, PA2, PA3, dan PA4 serta 11 spesi sulfur yang diberi notasi , SA1 hingga SA11. Diferensiasi dan distribusi spesi Mg, Ca, Mn, Zn, Mo, dan Cd juga dapat dipelajari berdasarkan profil elusinya setelah pemisahan SEC. Pada kolom sephadex G-50 SF terdeteksi minimal masing-masing 3 spesi Mg (MgA1, MgA2 dan MgA3), Ca (CaA1, CaA2 dan CaA3), Mn (MnA1, MnA2 dan MnA3), dan Zn (ZnA1, ZnA2 dan ZnA3), serta 2 spesi Mo (MoA1 dan MoA2) dan 5 spesi Cd (CdA1 -CdA5). Spesi pertama dari semua logam terdeteksi pada volum mati (> 44 kDa) yang bersesuaian dengan serapan aktif UV cairan floem. Kelimpahan relatif spesi pertama berkisar 0,01 % (spesi Mg) hingga 10,37 % (spesi Cd) dibandingkan spesi lainnya untuk masing-masing logam. Spesi utama logam dengan kelimpahan relatif yang tertinggi terdeteksi pada daerah berat molekul rendah (< 1350 Da). Spesi utama logam-logam tersebut berkorelasi positif dengan serapan aktif UV cairan floem. Adapun hasil pemisahan SEC pada kolom sephadex G-25 M terdeteksi 3 spesi Mg (MgB1, MgB2 dan MgB3) dan Zn (ZnB1, ZnB2 dan ZnB3), dua spesi Ca (CaB1 dan CaB2), Mn (MnB1 dan MnB2), dan Mo (MoB1 dan MoB2), serta satu spesi Cd (CdB1). Perbedaan pengkulturan tanaman jarak tidak berpengaruh terhadap diferensiasi spesi logam, namun berpengaruh terhadap jumlah total spesi. Pada media aeroponik, jumlah total spesi MnA2, spesi MoA2, dan semua spesi CdA lebih besar dibandingkan pada media pot. Hal ini menunjukkan pada media aeroponik, spesi biologis aktif (Bioavailability) logam Mn, Mo, dan Cd terserap lebih optimal dibandingkan dalam media pot. Hasil pemisahan dengan QPNC PAGE menunjukkan keberhasilan penelitian mendeteksi spesi Mn dan Mo dengan sangat baik. Spesi Mo terdeteksi pada daerah elusi 35-80 mL sedangkan spesi Mn pada daerah elusi 90-170 mL. Pemisahan spesi Mg, Ca, Zn, dan Cd dengan QPNC PAGE kurang optimal yang teramati dengan profil elusi spesi bergradasi dan tingginya batas kuantifikasi pendeteksian selektif unsur Mg, Ca, Zn, dan Cd. Hasil pengujian kemungkinan spesi logam berinteraksi dengan protein/polipeptida menunjukkan bahwa konsentrasi total spesi MgB1, spesi CaB1, spesi MnB1, MoB1, dan CdB1 berkurang secara signifikan sedangkan konsentrasi total spesi dengan berat molekul rendah dari Mg, Ca, Mn, Mo dan Cd bertambah setelah destruksi dengan proteinase K. Berkurangnya konsentrasi total spesi tersebut merupakan indikasi kemungkinan interaksi spesi dengan protein/polipeptida. Berbeda dengan spesi logam lainnya, tidak ada perbedaan profil elusi spesi Zn sebelum dan sesudah uji proteinase K. Hal ini menunjukkan kecil kemungkinan Zn berikatan dengan protein/polipeptida. Pembuktian keberadaan dan kestabilan spesi MoA2 dilakukan dengan SEC dan QPNC PAGE. Cairan floem pertama dipisahkan dengan SEC kolom sephadex G-50 SF. Fraksi SEC dengan konsentrasi Mo tertinggi (Fraksi 43/volume elusi 309,6 mL) dipisahkan lebih lanjut dengan QPNC PAGE. Strategi kedua, pemisahan tahap pertama dilakukan dengan QPNC PAGE kemudian fraksi QPNC PAGE dengan konsentrasi Mo tertinggi (fraksi 10/volume elusi 50 mL) dipisahkan lebih lanjut dengan SEC kolom sephadex G-50 SF. Hasil penelitian membuktikan keberadaan dan kestabilan spesi Mo yang terdeteksi secara kuantitatif dengan menggunakan kedua metode tersebut berhasil dipisahkan lebih lanjut dengan terdeteksinya 13 spesi aktif UV dalam waktu kurang dari 10 menit. Diharapkan kontribusi ilmiah penelitian yang dilakukan yaitu tentang diferensiasi dan distribusi spesi Mg, Ca, Mn, Zn, Mo, dan Cd dapat bermanfaat untuk mengetahui mekanisme proses transformasi dan transport spesi tersebut dalam cairan floem tanaman jarak.