Perpustakaan Digital ITB

?-Amilase merupakan enzim yang menghidrolisis ikatan ?-(1,4)-glikosidik pati. ?- Amilase digunakan pada berbagai industri, seperti industri pangan, farmasi, tekstil, kertas, dan deterjen. BmaN1 adalah salah satu enzim pendegradasi pati yang dihasilkan oleh Bacillus megaterium NL3 di Danau Kakaban, Kalimantan Timur, Indonesia. BmaN1 termasuk dalam keluarga GH13. Ciri umum dari keluarga GH13 adalah adanya residu katalitik berupa dua aspartat dan satu glutamat. BmaN1 hanya ditemukan residu Glu231 di daerah lestari, sedangkan satu aspartat diganti dengan His294 dan aspartat lain (Asp203) bergeser satu residu i+1 oleh Lys202. Ekspresi BmaN1 pada Escherichia coli menghasilkan protein dengan kelarutan rendah akibat adanya daerah transmembran di ujung C. Penelitian ini bertujuan melakukan konstruksi gen bmaN1 tanpa 22 residu hidrofobik di ujung C (bmaN1?C) serta karakterisasi fungsi residu Lys202, Glu231, dan His294 BmaN1?C pada hidrolisis pati. Fragmen gen bmaN1?C hasil amplifikasi diligasi ke dalam plasmid kloning pGEMT. Subkloning ke dalam plasmid ekspresi pET30a(+) dilakukan dengan memotong plasmid rekombinan pGEMT_bmaN1?C menggunakan XhoI dan NdeI. Untuk mengetahui fungsi residu di daerah lestari, plasmid rekombinan pET30a_bmaN1?C digunakan sebagai cetakan mutasi menggunakan metode Site Directed Mutgenesis (SDM). Tiga plasmid rekombinan yang mengandung mutan bmaN1?C dengan perubahan kodon menghasilkan substitusi K202D, E231Q, dan H294D. BmaN1 dan BmaN1?C yang diekspresikan menghasilkan protein dengan massa molekul berturut-turut, ~55 kDa dan ~49 kDa. Level ekspresi BmaN1?C tertinggi diperoleh pada inang E. coli ArcticExpress (DE3), kemudian diikuti oleh E. coli BL21 (DE3) RIPL dan E.coli BL21 (DE3). Aktivitas spesifik untuk lisat BmaN1, BmaN1?C, E231Q, dan H294D berturut-turut adalah 0,43 U/mg, 1,26 U/mg, 0,25 U/mg dan 0,59 U/mg, sedangkan K202D tidak mempunyai aktivitas. Berdasarkan hasil penelitian ini, diperkirakan bahwa substitusi K202D menghasilkan repulsi dan mengubah orientasi Asp203 yang berperan sebagai nukleofil, sedangkan Glu231 berperan sebagai donor proton, dan His294 merupakan penstabil transition state pada hidrolisis pati ?-amilase Bman1?C.