Perpustakaan Digital ITB

Enzim-enzim amilolitik terlibat dalam metabolisme karbohidrat berbagai organisme. Salah satu enzim amilolitik yang banyak dimanfaatkan adalah ????- amilase (EC 3.2.1.1). ????-Amilase pada tumbuhan dibutuhkan dalam perkecambahan biji, sedangkan pada hewan berperan pada sistem pencernaan. Berbagai bakteri mensekresi ????-amilase untuk menghidrolisis pati di lingkungannya sehingga menghasilkan maltooligosakarida yang dibutuhkan untuk pertumbuhan sel. ????-Amilase bakteri telah banyak diteliti, terutama yang berasal dari genus Bacillus. ????-Amilase termasuk ke dalam keluarga enzim glikosida hidrolase 13 (GH13). Struktur tiga dimensi enzim-enzim GH13 setidaknya terdiri atas tiga domain, yaitu domain A, B, dan C. Domain A memiliki pelipatan tong (????/????)8, domain B merupakan untai penghubung di antara untai ????3 dan heliks ????3 domain A, sedangkan domain C merupakan bagian ujung C polipeptida. ????-Amilase digunakan dalam industri pengolahan pati. Pengolahan pati konvensional memerlukan tahap gelatinisasi pada suhu tinggi untuk membuka struktur butir pati agar ????-amilase termostabil dapat bekerja. Hidrolisis pati dapat dilakukan tanpa tahap gelatinisasi jika ????-amilase termostabil diganti dengan ????-amilase pendegradasi butir pati. Saat ini belum banyak informasi tentang ????-amilase pendegradasi butir pati yang berasal dari bakteri laut. Salah satu bakteri terumbu karang yang berasosiasi dengan koral lunak Sinularia sp. dari perairan Pulau Merak Kecil, Banten, yaitu isolat MKSC 6.2 diketahui menghasilkan enzim yang dapat mendegradasi butir pati. Tujuan penelitian ini adalah untuk mengidentifikasi isolat MKSC 6.2, menentukan karakteristik biokimia enzim amilolitik isolat ini, dan mencari kerangka bacaan terbuka (open reading frame, ORF) penyandi ????-amilase. Penelitian ini juga bertujuan untuk mengekspresi gen penyandi ????-amilase dalam Escherichia coli dan menentukan kemampuan ????-amilase rekombinan tersebut untuk mendegradasi butir pati. Identifikasi isolat MKSC 6.2 secara molekular menggunakan metode analisis homologi urutan gen 16S rRNA menunjukkan bahwa isolat ini memiliki hubungan kekerabatan terdekat dengan Bacillus aquimaris MSU1110 dengan homologi sebesar 99,9%. Identifikasi berdasarkan sifat-sifat fisiologi dan morfologi juga menunjukkan bahwa isolat tersebut termasuk dalam kelompok spesies Bacillus aquimaris. Enzim amilolitik B. aquimaris MKSC 6.2 bekerja optimum pada suhu 50oC dan pH 6,5. Enzim ini dapat diadsorpsi oleh butir pati singkong (93%), beras (92%), jagung (89%), sagu (87%), dan kentang (65%). Enzim amilolitik ini menghidrolisis semua butir pati tersebut dengan derajat hidrolisis tertinggi terhadap butir pati jagung, yaitu mencapai 23%. Analisis menggunakan Scanning Electron Microscope (SEM) menunjukkan bahwa enzim amilolitik B. aquimaris MKSC 6.2 mendegradasi butir pati dengan dua pola, yaitu pembentukan pori pada butir pati yang berasal dari biji-bijian, dan pengelupasan permukaan pada butir pati yang berasal dari umbi dan batang. Analisis menggunakan kromatografi lapis tipis (KLT) menunjukkan bahwa hidrolisis pati dapat-larut (soluble starch) oleh enzim ini menghasilkan campuran maltosa, maltotriosa, maltotetraosa, maltoheptaosa, maltoheksaosa, dan sedikit glukosa. Analisis pada gel dengan pewarnaan aktivitas memperlihatkan setidaknya terdapat tujuh pita protein B. aquimaris MKSC 6.2 yang memiliki aktivitas amilolitik. ORF ????-amilase B. aquimaris MKSC 6.2 (baqA) berhasil diisolasi dengan kombinasi PCR menggunakan primer degenerasi dan PCR terbalik. ORF tersebut berukuran 1539 pb yang menyandi 512 residu asam amino. Penjajaran urutan asam amino ????-amilase B. aquimaris MKSC 6.2 (BaqA) dengan 33 ????-amilase lain dari berbagai bakteri, arkhea, fungi, tumbuhan, dan hewan menunjukkan bahwa BaqA dan tiga ????-amilase Bacillus lain membentuk kelompok subkeluarga baru yang terpisah dari subkeluarga GH13 lain yang telah diketahui. ????-Amilase B. aquimaris MKSC 6.2 rekombinan (rek-BaqA) yang diekspresikan di Escherichia coli BL21(DE3) membentuk badan-badan inklusi (agregat) sehingga memerlukan tahap pelipat-ulangan untuk menghasilkan protein aktif. Rek-BaqA mampu mendegradasi butir pati jagung dan singkong. Hasil degradasi butir pati jagung oleh rek-BaqA adalah campuran maltosa, maltotriosa, dan maltotetraosa, sedangkan hasil degradasi butir pati singkong berupa campuran glukosa, maltosa, maltotriosa, dan maltotetraosa. Karakteristik unik rek-BaqA hasil pelipatan-ulang yang berhasil ditemukan adalah kemampuannya untuk mendegradasi butir pati, tetapi tidak untuk pati dapat-larut. Model struktur tiga dimensi BaqA menunjukkan bahwa enzim ini tidak memiliki domain pengikat pati yang lazim ditemukan pada enzim-enzim pendegradasi butir pati. Pada BaqA, diperkirakan residu-residu yang berperan dalam pengikatan butir pati adalah dua residu triptofan bersebelahan (Trp201 dan Trp202) dan triad (Asp246, Arg247, dan Asp248) pada domain A; dan residu ‘penjepit gula’ (Tyr400) pada domain C. Struktur domain C BaqA yang disusun oleh lima untai ???? antiparalel juga diperkirakan berperan penting dalam pengikatan butir pati.